引文

之前的推文中，我們主要對(duì)scATAC-seq研究的科學(xué)問題作了簡單的介紹。這篇推文主要介紹scATAC-seq的技術(shù)原理和發(fā)展歷程。下面這張圖選自SnapATAC這個(gè)R包的作者Rongxin Fang的github上分享的內(nèi)容（https://github.com/r3fang/SnapATAC/blob/master/notebooks/experiemnt_timeline.md），記錄了從2015年到2019年期間scATAC-seq技術(shù)的發(fā)展。早期的scATAC-seq測序通量很低，而現(xiàn)在的scATAC-seq (常用的是10x) 能夠達(dá)到很高的通量。

早期scATAC-seq技術(shù)

scATAC-seq的技術(shù)原理最早見于2015的Shendure實(shí)驗(yàn)室在《Science》發(fā)表的文章《Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing》和Greenleaf實(shí)驗(yàn)室在《Nature》發(fā)表的文章《Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation》。其在技術(shù)原理上的差異見下圖。

這兩項(xiàng)技術(shù)的差異主要體現(xiàn)在獲取單細(xì)胞的方式上。Shendure實(shí)驗(yàn)室提出的技術(shù)方法采用了兩步的細(xì)胞索引策略（左圖）：裂解細(xì)胞后，約2500個(gè)細(xì)胞核進(jìn)入96孔板，然后含有特殊接頭的轉(zhuǎn)座酶分別加入每個(gè)孔板當(dāng)中，因此每個(gè)孔板中的細(xì)胞池都對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的barcode；接著混合每個(gè)孔板中的細(xì)胞核，通過流式細(xì)胞儀分選后的細(xì)胞核進(jìn)入第二個(gè)96孔板；在第二個(gè)96孔板上的細(xì)胞核被裂解成DNA，并將含有第二個(gè)barcode的引物對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。這個(gè)方法的基礎(chǔ)在于分離后90%的兩個(gè)barcode的組合信息能對(duì)應(yīng)到單個(gè)細(xì)胞上，但其主要缺陷在于每個(gè)細(xì)胞得到的reads的平均數(shù)目低于3000。Greenleaf實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的技術(shù)主要是通過物理方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離，基于納米級(jí)的反應(yīng)槽對(duì)其進(jìn)行ATAC-seq，但是每個(gè)反應(yīng)槽都需要通過顯微鏡進(jìn)行核驗(yàn)，確保獲取的是單個(gè)細(xì)胞。這種方法下，每個(gè)細(xì)胞得到的reads數(shù)目約為73000。從這兩項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)來看，早期獲取單細(xì)胞ATAC的技術(shù)方法相對(duì)是比較粗糙的，獲得的細(xì)胞數(shù)量也較少。

10x scATAC-seq

2018年，10x Genomics推出的scATAC-seq的技術(shù)方法成為現(xiàn)在最常用的scATAC-seq測序技術(shù)，其與10x的scRNA-seq技術(shù)都是通過凝膠微珠的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行包裹。下面這張圖主要介紹了10x scATAC-seq的建庫方法。

與10x scRNA-seq的建庫方法不同的是，scATAC-seq的凝膠微珠沒有UMI的相關(guān)標(biāo)簽，這是因?yàn)閟cRNA-seq需要通過UMI標(biāo)簽區(qū)分同一細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄本，而scATAC-seq是對(duì)細(xì)胞核中DNA的片段進(jìn)行ATAC-seq測序。另外一點(diǎn)，scRNA-seq只能對(duì)含有Poly(A)尾的RNA片段進(jìn)行測序，并需要將片段打斷，便于illumina測序；而scATAC-seq能夠?qū)?xì)胞核中所有的DNA進(jìn)行測序，并且不需要將DNA片段打斷。

Spatial-ATAC-seq

與RNA-seq的技術(shù)發(fā)展路線很相似，ATAC-seq技術(shù)的發(fā)展也呈現(xiàn)著由組織水平到單細(xì)胞水平最終達(dá)到空間水平的發(fā)展趨勢。2021年樊榮老師課題組在bioRxiv預(yù)印本上發(fā)布了空間ATAC-seq的技術(shù)方法，實(shí)現(xiàn)了在空間水平解析細(xì)胞的染色質(zhì)開放性。這篇文章通過對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的多個(gè)階段的Spatial-ATAC-seq分析，提供了小鼠胚胎發(fā)育的空間表觀圖譜。

總結(jié)

當(dāng)前scATAC-seq技術(shù)仍然處于發(fā)展中的階段，尤其是空間表觀組還處于萌芽階段。與bulk ATAC-seq相比，scATAC-seq對(duì)于開放染色質(zhì)區(qū)域的捕獲能力仍然是不足的，另外在scATAC-seq的細(xì)胞類型定義當(dāng)中，往往需要借助scRNA-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)行輔助，也是scATAC-seq分析中的一個(gè)難點(diǎn)。接下來，我們將介紹scATAC-seq的常用分析方法。