膀胱癌（BLCA）的預(yù)后管理仍然是臨床醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。最近，批量RNA-seq測序數(shù)據(jù)已被用作許多癌癥的預(yù)后標(biāo)志物，但不能準(zhǔn)確檢測腫瘤細胞中的關(guān)鍵細胞和分子功能。在目前的研究中，將大量RNA-seq和單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)結(jié)合起來，構(gòu)建BLCA的預(yù)后模型。

1.BLCA細胞亞型的鑒定

本研究的總體示意圖如下所示：首先，作者過濾了不合格的細胞，并產(chǎn)生了13，490個關(guān)鍵細胞用于后續(xù)分析（圖1A）. 對關(guān)鍵細胞進行了基因方差分析，作者發(fā)現(xiàn)2000個基因變化很大（圖1B）。1對三個單細胞樣品進行PCA（圖1C），并將單細胞樣品分散并分布，得出邏輯結(jié)果。同時，在PCA中，作者還選擇了p值<20.0的05個主成分（PC）進行后續(xù)分析（圖1D）。1然后，使用umap算法將關(guān)鍵細胞分類為19個獨立的細胞集群（圖1E,F).通過“singleR”包、CellMarker數(shù)據(jù)庫和參考文獻[17]尋找標(biāo)記基因，對不同的集群進行注釋，得到七個細胞，即B細胞、內(nèi)皮細胞、T細胞、單核細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和上皮細胞（圖1G）。通過氣泡圖可視化每種細胞類型的重要標(biāo)記基因的表達（圖1H）。散點圖顯示了標(biāo)記基因在不同細胞類型中的表達。此外，作者探索了不同細胞類型中癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAFs）的標(biāo)記基因（PDPN，THY1，PDGFRB，PDGFRA和POSTN）的表達，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)記基因在成纖維細胞中均高表達。可以總結(jié)每個已鑒定的標(biāo)記基因在特定細胞中的高表達，進一步說明了細胞類型測定的可靠性。

 圖1.單細胞RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定細胞集群，揭示BLCA腫瘤中的高細胞異質(zhì)性

2.關(guān)鍵細胞鑒定及其標(biāo)記基因功能富集分析

通過使用FindAllMars和Wilcoxon測試，獲得了474個顯著不同的標(biāo)記基因進行鑒定。通過計算每個細胞顯著不同的標(biāo)記基因的ssGSEA評分，作者發(fā)現(xiàn)所有七個細胞在BLCA中都顯著下調(diào)，因此七個細胞被認(rèn)為是后續(xù)分析的關(guān)鍵細胞（圖2A）。2關(guān)鍵細胞的標(biāo)記基因富集了GO和KEGG功能（圖2B-E）。作者注意到，除平滑肌細胞外，所有六種細胞類型的標(biāo)記基因都與細胞活化的正向調(diào)節(jié)有關(guān)，包括淋巴細胞和白細胞（圖2B）。2此外，單核細胞和T細胞的標(biāo)記基因與細胞因子-細胞因子受體相互作用有關(guān)。B細胞的標(biāo)記基因與p53信號通路相連。內(nèi)皮細胞、上皮細胞和平滑肌細胞的標(biāo)記基因與局灶粘附和ECM-受體相互作用有關(guān)（圖2E）. 對所有注釋的細胞分別進行偽時間分析，以使用 Monocle 2 算法探索其分化方向。結(jié)果表明，BLCA細胞逐漸遵循3個分化方向（圖3A）。上皮細胞比其他細胞分化更早，分化成兩個分支，其中一個由內(nèi)皮細胞主導(dǎo)，另一個由平滑肌細胞、成纖維細胞主導(dǎo)（圖3C）。此外，作者推斷了細胞-細胞通訊網(wǎng)絡(luò)，以根據(jù)特定的途徑和配體受體預(yù)測細胞間通訊。配體-受體對數(shù)量的熱圖顯示，成纖維細胞、T細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞的細胞通訊發(fā)生的頻率更高（圖）。3具體而言，內(nèi)皮細胞與上皮細胞之間、內(nèi)皮細胞與成纖維細胞之間以及內(nèi)皮細胞與T細胞之間相互作用的頻率和強度較高（圖3D）。此外，B細胞與其他細胞的相互作用相對罕見。

圖2.基于7個關(guān)鍵細胞的標(biāo)記基因功能富集分析

圖3.具有不同分化模式的三個BLCA細胞亞群的軌跡和細胞間通信分析

3.Bulk-RNA測序數(shù)據(jù)中DEG的鑒定和功能富集分析

共獲得1556個顯著DEG，其中上調(diào)基因708個，下調(diào)基因848個（圖4A,B）。GO分析表明，DEGs主要富集于細胞分裂、細胞器裂變、有絲分裂核分裂等細胞周期相關(guān)功能（圖4C-E）。KEGG富集結(jié)果表明，PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、貼壁點和細胞周期是DEGs的富集通路（圖4F)。

圖4.BLCA患者和對照組之間DEG的鑒定和功能富集分析

4.識別與BLCA相關(guān)的關(guān)鍵模塊

WGCNA用于鑒定參與BLCA發(fā)育和進展的基因。在共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程中，當(dāng)無標(biāo)度拓撲的擬合指數(shù)達到5.0時，軟閾值功率β為85（圖5A,B).將MEDissThres設(shè)置為0.2以合并動態(tài)剪切樹算法分析的類似模塊，合并后，最終共有10個模塊可用（圖5C,D）。.基于相關(guān)系數(shù)和P值，作者選擇MEbrown作為關(guān)鍵模塊（包含2334個基因）（圖5E）。關(guān)鍵模塊基因詳見圖5F，具有臨床相關(guān)性的棕色模塊的散點圖。

圖5. BLCA相關(guān)基因由WGCNA篩選

5.基于3個特征基因的預(yù)后模型的構(gòu)建與驗證

使用Ven圖證明了細胞亞型的標(biāo)記基因，BLCA模塊基因和DEG的交叉，共取123個交叉基因并定義為候選基因（圖6A)。然后，利用TCGA-BLCA中的訓(xùn)練集進行單因素Cox回歸分析，10個基因與OS顯著相關(guān)（圖6B）。接下來，使用LASSO算法篩選基因以進行模型構(gòu)建。結(jié)果如圖6C所示，以最小的交叉驗證錯誤篩選3個特征基因：PCOLCE2，MAP1B和ELN。風(fēng)險評分 = 0.09876179 × PCOLCE2 + 0.04635731 × MAP1B + 0.01686333 × ELN。根據(jù)臨界值=0.15，患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組（圖6D）。Kaplan-Meier分析顯示，高風(fēng)險評分患者的OS和無病生存期（DFS）明顯低于低風(fēng)險評分的患者（圖6E）。為了進一步評估風(fēng)險模型的有效性，計算了OS的ROC曲線，1、2、3、4和5年的AUC值均大于0.59，表明風(fēng)險模型的有效性更好（圖6F）。作者還在內(nèi)部驗證集和外部驗證集中對模型進行了功能驗證。GSE13507和GSE32548，結(jié)果表明該模型具有準(zhǔn)確性。總之，作者的預(yù)后模型在BLCA中顯示出出色的預(yù)測效率。

圖6.在TCGA隊列中構(gòu)建風(fēng)險特征

6.分析風(fēng)險評分和不同的臨床特征

為分析風(fēng)險評分表達與臨床特征的相關(guān)性，根據(jù)不同組別的臨床特征分別比較患者風(fēng)險評分的差異。結(jié)果表明，風(fēng)險評分在N期、T期和OS狀態(tài)上存在顯著差異（圖7B）。風(fēng)險模型的熱圖和臨床特征如圖7A所示。臨床特征分層分析顯示，臨床M0期，男性，III-IV期，T1-T2期，年齡>60歲和TMB_hight在高危和低風(fēng)險組中生存率存在顯著差異。綜上所述，作者基于3個特征基因的預(yù)后模型具有優(yōu)異的預(yù)后價值。

圖7.風(fēng)險評分與臨床特征的相關(guān)性分析

7.獨立預(yù)后因素的篩查和列線圖的構(gòu)建

為了篩選獨立的預(yù)后因素，對臨床特征和風(fēng)險評分進行了單變量和多變量Cox分析。作者發(fā)現(xiàn)RiskScore和Stage是患者的獨立預(yù)后因素（圖8A,B）。列線圖模型中包括兩個獨立的預(yù)后因素（圖8C)。此外，校準(zhǔn)曲線表明該模型具有較高的預(yù)測效果（圖8D）。因此，作者的結(jié)果表明，風(fēng)險評分是一個獨立的預(yù)后因素，列線圖對預(yù)測BLCA患者的OS具有較高的預(yù)測效果。

圖8.列線圖模型基于單變量和多元cox回歸分析構(gòu)建

8.高危和低危人群之間的 GSEA病

為了分析高風(fēng)險和低風(fēng)險亞組對癌癥進展的影響，作者進行了GSEA以確定兩組之間最重要的富集途徑。結(jié)果表明，高危人群在免疫應(yīng)答中涉及的細胞活化和體液免疫應(yīng)答等免疫過程顯著富集（圖9A)。KEGG表明，趨化因子信號通路、補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等通路在高危組中富集，低危組富集吞噬體相關(guān)通路（圖9B）。作者還使用GSVA分析了高風(fēng)險和低風(fēng)險組的所有基因。結(jié)果表明，高表達組在肌生成、MYC靶點V2、早期雌激素反應(yīng)、胰腺β細胞、DNA修復(fù)、MYC靶點V1、頂端連接、KRAS信號通路、過氧化物酶體、IL6 JAK STAT3和血管生成MYC靶點的標(biāo)記條目中被激活，而低表達組在缺氧、脂肪生成、 血紅素代謝、膽汁酸代謝、干擾素α反應(yīng)途徑、凝血等標(biāo)志物條目（圖9C,D)。

圖9.高危和低危人群之間的生物學(xué)特征

9.評估BLCA免疫治療的可能性

使用ssGSEA估計不同風(fēng)險組中28個免疫細胞的浸潤評分。結(jié)果表明，除天然免疫細胞外，25種免疫細胞的浸潤水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。killers.cell，Monocyte和T.helper.cell（圖10A）。皮爾遜相關(guān)結(jié)果顯示，預(yù)后基因和風(fēng)險評分均與免疫細胞浸潤顯著相關(guān)（圖10B）。16個GEP基因（炎癥基因）和4個免疫檢查點在高危和低危組中差異顯著（圖10C）。16個差異GEP基因和排名前4的途徑（T細胞活化，T細胞活化調(diào)節(jié)，白細胞細胞間粘附調(diào)節(jié)，白細胞細胞間細胞粘附）的相互作用網(wǎng)絡(luò)如圖10D所示，它強調(diào)了GEP基因與這些途徑之間的密切聯(lián)系。差異GEP基因的PPI網(wǎng)絡(luò)顯示了每個GEP基因之間的聯(lián)系（圖10E）。PD-1、PD-L1、CTLA-4和TIGIT在高危和低危組中是不同的（圖10F）。通過SubMap，在免疫治療隊列（Roh隊列）中，對ICB進行高危和低風(fēng)險組的反應(yīng)進行評估。作者發(fā)現(xiàn)CTLA-4免疫位點在Roh隊列中是敏感的（圖10G）。作者發(fā)現(xiàn)BLCA患者主要以錯義突變和SNPs為主（圖11A）。高危組和低危組突變結(jié)果顯示，高危組和低危組多數(shù)突變類型為錯義突變。高危組突變比例高于低危組，高危組突變負荷指數(shù)TMB指數(shù)總體高于低危組（圖11B）。最重要的是，作者的結(jié)果表明免疫療法在BLCA中具有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

圖11.BLCA中的突變景觀分析

10.高危和低危人群藥敏分析

從GDSC數(shù)據(jù)庫中，作者發(fā)現(xiàn)12種藥物與風(fēng)險評分呈負相關(guān)（R < -0.4和p < 0.05），圖12A中僅顯示前7種藥物。此外，作者探討了12種藥物的靶點和途徑，其中5種沒有相應(yīng)的數(shù)據(jù)。12種化療藥物在高危組和低危組間差異顯著（圖12B）。在CTRP數(shù)據(jù)庫中，藥物星形孢素，CCT036477，XL765，TGX.221和舒尼替尼與風(fēng)險評分的負相關(guān)性最強（圖12C）。同時，5種藥物的AUC值在高危組和低危組均存在顯著差異（圖12D）?？傊@些藥物可能對BLCA的治療有希望。

圖12.基于風(fēng)險模型篩選BLCA治療藥物

總結(jié)

通過整合scRNA-seq和批量RNA-seq數(shù)據(jù)，作者進行了多種機器學(xué)習(xí)方法，并建立了一種新的BLCA患者OS預(yù)測預(yù)后模型，可用于預(yù)測BLCA患者的生存概率。此外，風(fēng)險評分是一個有希望的獨立預(yù)后因素，與免疫微環(huán)境和臨床病理特征密切相關(guān)?？傮w而言，這項研究可以作為BLCA療效的可靠預(yù)測指標(biāo)，為未來BLCA的靶向治療開辟了新的途徑。對這篇文章的思路感興趣的老師，歡迎掃碼咨詢！