通過 CRISPR-Cas9 進(jìn)行的基因編輯在生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的潛力，但目前的技術(shù)在插入大片段 DNA 序列方面的效果有限。

近日，來自麻省理工學(xué)院的研究員 Omar Abudayyeh、Jonathan Gootenberg 及其同事開發(fā)了一種稱為 PASTE 的技術(shù)，該技術(shù)有可能用于插入長鏈 DNA 并治療由具有大量突變的缺陷基因引起的疾病，例如囊性纖維化和 Leber 先天性黑蒙癥，后者是一種導(dǎo)致失明的罕見眼病。相關(guān)研究以題為“Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases”發(fā)表于 Nature Biotechnology 期刊。

Gootenberg 和 Abudayyeh 是這項(xiàng)新研究的通訊作者，該研究的主要作者是麻省理工學(xué)院技術(shù)助理 Matthew Yarnall 和 Rohan Krajeski、麻省理工學(xué)院研究生 Cian Schmitt-Ulms 等。

Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 是張鋒的學(xué)生，現(xiàn)在兩人都是麻省理工學(xué)院麥戈文腦科學(xué)研究所的研究員。畢業(yè)后，兩人在麥戈文腦科學(xué)研究所共同成立了實(shí)驗(yàn)室 Abudayyeh-Gootenberg Lab。實(shí)驗(yàn)室的主要研究方向是構(gòu)建和應(yīng)用下一代分子工具。即將生物學(xué)發(fā)現(xiàn)和分子工程相結(jié)合，開發(fā)一套用于操作 DNA、RNA 和細(xì)胞狀態(tài)的新工具——細(xì)胞工程工具箱，并將這些工具應(yīng)用于調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)、衰老以及遺傳疾病。

根據(jù)研究，通過 PASTE，研究人員可以在他們想要的位置插入長達(dá) 36,000 個(gè)堿基對的序列。

可定點(diǎn)插入長達(dá) 36000 個(gè)堿基對的序列

通過 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)將感興趣的序列整合到細(xì)胞的基因組 DNA 中需要 Cas9 讓雙鏈斷裂，并激活細(xì)胞的同源定向修復(fù) (HDR) 通路以響應(yīng)破壞，便于序列整合。然而，在大多數(shù)細(xì)胞和細(xì)胞周期的階段中，非 HDR 途徑（例如非同源末端連接）占主導(dǎo)地位；在非分裂細(xì)胞中，HDR 大部分處于非活動(dòng)狀態(tài)，使得有效整合幾乎不可能。此外，所有基于 DNA 雙鏈斷裂修復(fù)的方法都容易出錯(cuò)，導(dǎo)致插入或缺失、DNA 易位和細(xì)胞凋亡途徑的激活等。

2019 年，Prime Editing 的開發(fā)將基因編輯提升到了一個(gè)新的水平，這種方式允許引入所有突變類型，包括插入、缺失等。Prime Editing 在 Cas9 酶和 gRNA 兩方面進(jìn)行了改造：將 Cas9 酶的變體與逆轉(zhuǎn)錄酶融合，形成融合蛋白復(fù)合體；在 gRNA 3'末端增加了一段 RNA 序列，形成所謂的 pegRNA。

之后，劉如謙將 Prime Editing 進(jìn)行了優(yōu)化，升級(jí)為 twinPE（twin Prime Editing）。它使用 2 個(gè) pegRNA 序列，與標(biāo)準(zhǔn)的 prime 編輯相比，后者提高了效率并增加了插入、刪除、倒置、替換的大小。該團(tuán)隊(duì)還將 twinPE 與絲氨酸整合酶 Bxb1 相結(jié)合以插入 5kb 序列，并使用組合技術(shù)介導(dǎo)導(dǎo)致亨特綜合征的基因發(fā)生 40kb 倒位。

基于上述研究，劉如謙創(chuàng)辦了 Prime Medicine 公司，該公司也于一個(gè)月前登陸納斯達(dá)克。目前，Prime Medicine 共有 18 個(gè)臨床前研發(fā)管線，針對肝臟、離體造血干細(xì)胞、眼睛、耳、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)、肺等多個(gè)器官和組織，遞送載體包括 AAV、LNP，以及其他非病毒載體。

在此次研究中，研究人員將 Prime Editing 的功能與整合酶的序列特異性整合能力相結(jié)合。他們將絲氨酸整合酶 Bxb1 與現(xiàn)有的 Cas9 切口酶和逆轉(zhuǎn)錄酶融合。絲氨酸整合酶可以插入大片段 DNA，長達(dá) 50,000 個(gè)堿基對。

（來源：上述論文）

組合技術(shù)背后的想法是，整合酶本身不容易被設(shè)計(jì)為插入到除其特定目標(biāo)序列之外的任何位置，但它們能夠攜帶大序列。與此同時(shí)，可以設(shè)計(jì) Prime 編輯器來靶向和編輯特定位點(diǎn)，但僅限于剛好足以插入整合酶的目標(biāo)序列。

據(jù) Abudayyeh 表示，與目前的基因編輯方法不同，后者只能同時(shí)追蹤一種疾病的單個(gè)突變，PASTE 可以通過替換整個(gè)基因同時(shí)解決許多突變。此外，該技術(shù)不會(huì)在 DNA 中產(chǎn)生雙鏈斷裂，從而降低了不需要的插入或刪除的風(fēng)險(xiǎn)。

事實(shí)證明，通過在 PASTE 中結(jié)合兩者，研究人員可以在他們想要的位置插入多達(dá) 36,000 個(gè)堿基對的序列。

但劉如謙也在一封郵件中指出，“在我們實(shí)驗(yàn)室，主要編輯器-重組酶融合的平均效果并不比簡單地將重組酶表達(dá)為單獨(dú)的蛋白質(zhì)更好，而且在某些情況下，融合的效率低于單獨(dú)表達(dá)的蛋白質(zhì)?！?/span>

賓夕法尼亞大學(xué)教授兼 Verve Therapeutics 聯(lián)合創(chuàng)始人 Kiran Musunuru 和哥倫比亞大學(xué)教授兼 Prime Medicine 的顧問 Sam Sternberg 都表示，他們認(rèn)為兩者相似?！坝泻艽髤^(qū)別嗎？我認(rèn)為無論是兩種不同的蛋白質(zhì)分別制造還是單一蛋白質(zhì)都沒有太大關(guān)系，他們似乎都工作得相當(dāng)好。”Musunuru 表示。

相關(guān)技術(shù)已授權(quán)公司

在這項(xiàng)研究中，研究人員表明他們可以使用 PASTE 將基因插入多種類型的人類細(xì)胞，包括肝細(xì)胞、T 細(xì)胞和淋巴母細(xì)胞（未成熟的白細(xì)胞）。他們使用 13 種不同的有效載荷基因（包括一些可能具有治療作用的基因）測試了遞送系統(tǒng)，并能夠?qū)⑺鼈儾迦牖蚪M的 9 個(gè)不同位置。

在這些細(xì)胞中，研究人員能夠以 5% 到 60% 的成功率插入基因。但這種方法在基因整合位點(diǎn)產(chǎn)生了極少不需要的插入或缺失?！拔覀兛吹降牟迦肴笔Ш苌?，而且因?yàn)槲覀儧]有制造雙鏈斷裂，所以不必?fù)?dān)心染色體重排或大規(guī)模染色體臂缺失?！?a style="margin: 0px; padding: 0px; color: rgb(87, 107, 149); border: 0px; outline: 0px; -webkit-tap-highlight-color: rgba(0, 0, 0, 0); cursor: pointer; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">Abudayyeh 說。

研究人員還證明，他們可以將基因插入小鼠的“人源化”肝臟中。這些小鼠的肝臟由大約 70% 的人類肝細(xì)胞組成，PASTE 成功地將新基因整合到大約 2.5% 的上述細(xì)胞中。

研究人員現(xiàn)在正在進(jìn)一步探索使用該工具作為替代有缺陷的囊性纖維化基因的方法的可能性。該技術(shù)還可用于治療由缺陷基因引起的血液疾病，例如血友病和 G6PD 缺陷，或亨廷頓氏病，這是一種由具有過多基因重復(fù)的缺陷基因引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

目前，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)授權(quán)給 Tome Biosciences，一家由 Omar Abudayyeh 和 Jonathan Gootenberg 于 2021 年 2 月共同創(chuàng)立的生物技術(shù)公司，并得到 ARCH、a16z、Longwood Fund、Polaris Partners 和 Alexandria Ventures 的支持。根據(jù)美國證券交易委員會(huì) 4 月份提交的一份文件，Sana Biotechnology 也持有該公司的股份，該公司是一家成立于 2018 年的細(xì)胞和基因療法公司，目前已在納斯達(dá)克掛牌上市。

▲圖 | Tome Biosciences 融資情況 （來源：CB Insights）

值得注意的是，Tome Biosciences 沒有 Prime Medicine 的許可，Prime Medicine 的一位發(fā)言人告訴外媒，目前還沒有就此進(jìn)行談判。

Abudayyeh 和 Gootenberg 強(qiáng)調(diào)，雖然他們在論文中使用了 Prime Editing，但更通用的 PASTE 框架并不局限于 Prime Editing?！癙rime 就是一個(gè)例子，但不是唯一的方法?！盙ootenberg 稱。

目前，Tome Biosciences 公司并無過多信息披露，這家總部位于馬薩諸塞州沃特敦的生物技術(shù)公司由首席執(zhí)行官 Rahul Kakkar 領(lǐng)導(dǎo)，截至今年第三季度擁有 80 多名全職員工。Tome 方透露希望到 2026 年有管線進(jìn)入臨床進(jìn)入臨床。