小RNA（sRNA）是一類短片段的非編碼RNA，在真核生物中廣泛存在。sRNA，尤其是miRNA，被報(bào)道對(duì)植物的生長發(fā)育和逆境脅迫應(yīng)答起到重要的調(diào)控作用。植物基因組上普遍存在一類反向重復(fù)結(jié)構(gòu)（Inverted repeat, IR），能夠產(chǎn)生大量的sRNA。盡管知道這些IR產(chǎn)生的sRNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，但I(xiàn)R對(duì)作物發(fā)育的具體調(diào)控功能直到近年才在大豆上被報(bào)道。作物產(chǎn)量和環(huán)境脅迫抗性都是由微效多基因控制的復(fù)雜農(nóng)藝性狀，涉及到全基因組范圍內(nèi)眾多基因的表達(dá)及其調(diào)控。IR是否及如何通過產(chǎn)生sRNA調(diào)控基因的表達(dá)進(jìn)而控制玉米產(chǎn)量和環(huán)境脅迫耐受性迄今未知。

2022年10月13日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)代明球課題組聯(lián)合李峰、李林課題組在Nature Biotechnology雜志發(fā)表了題為The role of transposon inverted repeats in balancing drought tolerance and yield-related traits in maize的研究長文，利用多組學(xué)和基因編輯策略，詳細(xì)闡述了玉米產(chǎn)量和抗性平衡的遺傳與分子機(jī)制，為玉米高抗高產(chǎn)精準(zhǔn)分子設(shè)計(jì)育種奠定了理論基礎(chǔ)，提供了優(yōu)異基因資源。

主要研究結(jié)果

1. 大規(guī)模鑒定響應(yīng)干旱脅迫的sRNA并解析其遺傳調(diào)控機(jī)制

通過高通量測(cè)序，作者獲得了338份玉米關(guān)聯(lián)群體在正常澆水（WW）和干旱脅迫（DS）生長條件下的sRNA表達(dá)組和其中197份群體的轉(zhuǎn)錄組。從中檢測(cè)到三萬多個(gè)響應(yīng)干旱脅迫的sRNA并獲得其群體水平的表達(dá)性狀。sRNA對(duì)基因表達(dá)有調(diào)控作用。在群體范圍內(nèi)通過回歸分析共發(fā)現(xiàn)6158對(duì)sRNA-基因調(diào)控關(guān)系，其中有許多已知的miRNA-基因調(diào)控關(guān)系（如miR168對(duì)AGO1c的調(diào)控、miR169 對(duì)NF-YA8的調(diào)控、miR167對(duì)ARF6的調(diào)控等），同時(shí)也發(fā)現(xiàn)許多新的sRNA對(duì)基因的調(diào)控關(guān)系。對(duì)上述sRNA表達(dá)性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（eGWAS），共獲得6000來個(gè)調(diào)控sRNA表達(dá)的eQTL，其中有29個(gè)是eQTL熱點(diǎn)，能同時(shí)調(diào)控20個(gè)以上sRNA的表達(dá)。比較分析調(diào)控sRNA表達(dá)的eQTL和調(diào)控基因表達(dá)的eQTL發(fā)現(xiàn)，有4722個(gè)eQTL能同時(shí)控制sRNA和基因的表達(dá)，表明sRNA和基因之間存在大量的全基因組協(xié)同調(diào)控關(guān)系。

圖1. 群體范圍內(nèi)鑒定sRNA和基因表達(dá)并解析其遺傳調(diào)控機(jī)制

2. DRESH8調(diào)控玉米抗旱的功能與機(jī)制解析

通過預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)29個(gè)eQTL熱點(diǎn)所產(chǎn)生的sRNA調(diào)控2764個(gè)潛在的靶基因。其中，530個(gè)基因（19.2%）與植物繁殖相關(guān)，891個(gè)基因（32.2%）與脅迫應(yīng)答相關(guān)，表明這些seQTL熱點(diǎn)在調(diào)控玉米產(chǎn)量和環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮重要功能。為了進(jìn)一步解析作物產(chǎn)量和環(huán)境適應(yīng)性分子調(diào)控機(jī)制，作者克隆了8號(hào)染色體上一個(gè)干旱特異性超級(jí)熱點(diǎn)eQTL DRESH8，該熱點(diǎn)eQTL與上千個(gè)sRNA表達(dá)相關(guān)，且僅在DS條件下被檢測(cè)到。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)DRESH8是一個(gè)由吉普賽類轉(zhuǎn)座元件(TE)組成、有21.4kb的反向重復(fù)結(jié)構(gòu)（TE-IR）變異。該TE-IR插入ZmPP2C16基因第三個(gè)內(nèi)含子，并受到該基因啟動(dòng)子的調(diào)控，在干旱環(huán)境下誘導(dǎo)性啟動(dòng)表達(dá)。另外，DRESH8對(duì)插入的本地基因沒有明顯的調(diào)控作用，其可能通過產(chǎn)生sRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因起調(diào)控作用。

群體中，缺乏DRESH8的玉米sRNA表達(dá)量低，但其干旱脅迫下的存活率高于攜帶DRESH8的玉米。進(jìn)一步，通過基因編輯手段獲得缺失DRESH8的轉(zhuǎn)基因玉米，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因玉米比野生型對(duì)照玉米更抗旱，且其產(chǎn)生的sRNA比野生型顯著減少，表明DRESH8是玉米群體內(nèi)抗旱性變異和sRNA表達(dá)變異的因果變異位點(diǎn)。通過mRNA切割實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DRESH8產(chǎn)生的sRNA對(duì)下游包括ZmMYBR38 在內(nèi)30個(gè)左右的基因有切割作用。通過在玉米和擬南芥中過表達(dá)ZmMYBR38基因來檢測(cè)該基因的抗旱作用，發(fā)現(xiàn)兩組過表達(dá)ZmMYBR38的轉(zhuǎn)基因植物都比相應(yīng)的野生型非轉(zhuǎn)基因植物更耐旱，說明ZmMYBR38在植物抗旱中發(fā)揮保守和積極的作用。這些數(shù)據(jù)表明，DRESH8產(chǎn)生的siRNA通過介導(dǎo)下游靶標(biāo)mRNA的切割來調(diào)控植物的耐旱性。

圖2. DRESH8通過其產(chǎn)生的sRNA來調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)而抑制玉米抗旱

3.DRESH8介導(dǎo)玉米抗旱性與產(chǎn)量的平衡

接下來作者詳細(xì)研究了DRESH8的進(jìn)化與選擇。利用不同的分析手段均發(fā)現(xiàn)DRESH8位點(diǎn)存在較強(qiáng)的選擇信號(hào)。利用包括玉米祖先大芻草、農(nóng)家種和現(xiàn)代玉米自交系在內(nèi)一共上千分玉米種質(zhì)資源，進(jìn)一步探究DRESH8的起源和傳播。結(jié)果表明，DRESH8轉(zhuǎn)座子的大致起源時(shí)間是51800年前，DRESH8的缺失可能是在較近的大芻草適應(yīng)環(huán)境脅迫變化過程中被自然選擇的，而DRESH8等位基因的存在則可能是在玉米的馴化和傳播過程中被人為選擇保留下來?？紤]到DRESH8的存在不利玉米抗旱，是什么驅(qū)動(dòng)了DRESH8被選擇保留？為了回答這一重要問題，作者獲取了兩方面數(shù)據(jù)。一是降雨量與DRESH8的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)，降雨量在種植含有DRESH8玉米的地區(qū)要比種植不含有DRESH8玉米的地區(qū)要高。二是產(chǎn)量與DRESH8的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)，就產(chǎn)量性狀而言（如穗長、穗直徑、粒長、粒寬、粒厚、百粒重等），含有DRESH8的野生型玉米要比不含DRESH8的基因編輯玉米提高5%-14%，即DRESH8的存在有利于提高玉米產(chǎn)量?；谶@些結(jié)果，作者提出了一個(gè)模型來解釋DRESH8位點(diǎn)是如何被選擇的：在降雨充沛的環(huán)境中，農(nóng)民可能選擇種植有DRESH8的玉米以提高產(chǎn)量；而在干旱環(huán)境下，農(nóng)民選擇種植缺失DRESH8的玉米，這樣可以去除DRESH8產(chǎn)生的sRNA對(duì)抗旱基因的抑制作用，從而提高玉米的抗旱性。以上這些數(shù)據(jù)表明，DRESH8能夠介導(dǎo)耐旱性和產(chǎn)量性狀之間的選擇平衡，進(jìn)而影響玉米在世界范圍內(nèi)的傳播。

圖3. DRESH8的進(jìn)化與選擇

4. 全基因組范圍內(nèi)的IR及其平衡產(chǎn)量和抗性的潛在功能

為了更全面地描述IR在玉米響應(yīng)干旱中的普遍作用，作者研究了全基因組范圍內(nèi)的IR結(jié)構(gòu)?；贐73基因組，一共鑒定到8261個(gè)IR；盡管這些IR僅占玉米基因組的1.2%，卻控制了42%左右的干旱應(yīng)答sRNA的表達(dá)，表明IR在玉米干旱響應(yīng)中發(fā)揮著廣泛的作用。 玉米基因組85%都是TE，在8261個(gè)IR中，TE-IR占比高達(dá)90.7%，產(chǎn)生86.9%的IR sRNA。TE在形成IR結(jié)構(gòu)后以產(chǎn)生22-nt sRNA為主，而不形成IR結(jié)構(gòu)的TE則以產(chǎn)生24-nt sRNA為主。另外，由IR產(chǎn)生的22-nt sRNA占全基因組范圍內(nèi)22-nt sRNA的70%左右。在TE-IR中，大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子(除DHH和DTA外)形成較短的IR (<5 kb)，而逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子傾向于形成較大的IR (>10 kb)。IR產(chǎn)生的大多數(shù)21-和22-nt sRNA在干旱后上調(diào)表達(dá)，而且，這些IR sRNA還介導(dǎo)了包括低溫和鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，表明IR sRNA在調(diào)節(jié)植物響應(yīng)不同環(huán)境脅迫方面具有普遍性作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在馴化和改良的過程中，無論是IR長度還是數(shù)目都出現(xiàn)擴(kuò)張，對(duì)粒長的選擇可能是IR擴(kuò)張的重要驅(qū)動(dòng)因素之一。此外，有23個(gè)eQTL熱點(diǎn)為TE-IR結(jié)構(gòu)變異，其中有21個(gè)TE-IR產(chǎn)生的sRNA所調(diào)控的潛在靶基因富集到與產(chǎn)量和抗逆性相關(guān)的基因集中。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明IR，特別是TE-IR，可能在調(diào)節(jié)玉米環(huán)境適應(yīng)性與產(chǎn)量性狀平衡上具有普遍作用。

圖4. 全基因組范圍內(nèi)的IR及其在調(diào)控玉米產(chǎn)量和抗性方面的潛在功能

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)了大量與干旱適應(yīng)性和產(chǎn)量性狀相關(guān)的環(huán)境特異性遺傳調(diào)控因子。研究結(jié)果突出了TE在形成IR結(jié)構(gòu)中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。這些IR結(jié)構(gòu)主要通過DCL2控制sRNA的表達(dá)，并參與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，IR的這種作用方式是玉米環(huán)境適應(yīng)性和作物產(chǎn)量性狀之間平衡的關(guān)鍵遺傳與分子調(diào)控機(jī)制。這種由TE-IR結(jié)構(gòu)驅(qū)動(dòng)的平衡機(jī)制，為通過基因組精準(zhǔn)設(shè)計(jì)來培育高抗高產(chǎn)作物鋪平了道路。

中國科學(xué)院植物研究所種康院士團(tuán)隊(duì)在植物學(xué)報(bào)上發(fā)表了熱點(diǎn)評(píng)述文章，認(rèn)為“全基因組范圍內(nèi)這些IR位點(diǎn)及其優(yōu)異等位變異有望為玉米設(shè)計(jì)育種提供大量有價(jià)值的遺傳靶點(diǎn)。一方面, 可以根據(jù)區(qū)域環(huán)境特征, 選擇利用這些IR進(jìn)行偏向產(chǎn)量或側(cè)重抗性的區(qū)域個(gè)性化育種。另一方面, 盡管包括DRESH8在內(nèi)的眾多IR對(duì)環(huán)境脅迫抗性起負(fù)調(diào)控作用, 但在育種上可根據(jù)這些IR起作用的確切機(jī)制進(jìn)行精準(zhǔn)設(shè)計(jì), 從而降低其對(duì)抗性的負(fù)調(diào)控作用。例如, DRESH8分子模塊不利于抗旱但有利于產(chǎn)量, 可針對(duì)其特定siRNA產(chǎn)生位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯介導(dǎo)的定點(diǎn)突變, 消除這些siRNA對(duì)抗旱基因的抑制作用, 將改良后的DRESH8用于高抗高產(chǎn)玉米新品種的培育, 便可做到“魚和熊掌”兼得。”

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士后孫霄鵬、向艷麗博士（現(xiàn)根特大學(xué)博士后）、博士生豆楠楠、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后張慧為論文的第一作者。作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和湖北洪山實(shí)驗(yàn)室的代明球教授、李林教授以及園藝生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的李峰教授為論文的通訊作者。作物遺傳改良全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和湖北洪山實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)建兵教授也參與了該項(xiàng)工作。本研究得到了基金委國際合作和面上項(xiàng)目、十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中央高?；痦?xiàng)目、湖北洪山實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目的主要資助。

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