01

摘要

花青素積累是植物在環(huán)境脅迫下的顯著表型。植物色素相互作用因子 (PIF)通過與 MYB-bHLH-WD40 (MBW) 復(fù)合物相互作用參與環(huán)境誘導(dǎo)的花青素生物合成。然而，這種相互作用的分子機制仍不清楚。本研究表明，在 NaCl、低氮 (-N) 或 6-BA 處理下，PIF3 和 PIF5 可以輕微抑制花青素的積累；相比之下，PIF4 可以顯著抑制花青素的積累。雙分子熒光互補和酵母雙雜交試驗表明 PIF4 直接與花青素色素的MBW 復(fù)合物中的 MYB 轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生相互作用 1 (PAP1)。進(jìn)一步分析表明， PIF4的N末端的活性光敏色素結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (APB) 對于 PIF4 和 PAP1 之間的相互作用是必需的。酵母三雜交分析表明，PIF4 與 TRANSPARENT TESTA 8 (TT8) 競爭結(jié)合 PAP1，從而干擾 MBW蛋白復(fù)合物在花青素合成中的調(diào)節(jié)。綜上所述，PIF4在不同脅迫環(huán)境下對擬南芥花青素生物合成具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，PIF4與PAP1相互作用影響MBW復(fù)合物的完整性。

03

主要結(jié)果

3.1 PIF4負(fù)調(diào)控不同環(huán)境因素誘導(dǎo)的花青素積累

在本研究中，我們研究了PIF3、PIF4 、 PIF5突變體（pif3-3、pif4-2、pif5-2、pifq）和過表達(dá)菌株（35S::PIF3、35S::PIF4、和35S::PIF5)在 6-BA、MeJA、缺氮(-N) 和 NaCl 處理下。正常情況下，pif3-1、pif4-2、 pifq 、35S::PIF3、35S::PIF4、35S::PIF5的花青素含量與 Col-0 相似，但pif5-2突變體的花青素含量比 Col-0 增加了 66.7%（圖1A）。圖 1B表明pif3-1和 Col-0 在 10 μM 6-BA 處理 5 d 下的花青素含量沒有差異，而在pif4-2和pif5-2中，花青素含量增加了 91.1%和 74.8%，分別。此外，在pifq中觀察到最高的花青素水平（比 Col-0 高 159.8%）。此外，過表達(dá)PIF4 ( 35S::PIF4) 導(dǎo)致在 6-BA 處理下顯著抑制花青素積累，但35S::PIF5中的花青素含量與 Col-0 中的花青素含量沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明PIF4和PIF5均參與調(diào)控6-BA誘導(dǎo)的花青素積累，且PIF4比PIF5起更重要的作用。

圖1C顯示，在50 μM MeJA處理5天后，pif3-1、pif4-2和pif5-3中PIF3、PIF4和PIF5的功能障礙導(dǎo)致花青素積累增加。pif3-1、pif4-2和pif5-3 分別增加了 155.5%、217.6% 和 83.3%。同樣，在pifq中觀察到最高水平（比 Col-0 高 247.9%）。然而，MeJA 誘導(dǎo)的花青素積累僅在35S::PIF4中受到抑制，而在35S::PIF3和35S::PIF5 中則不受抑制。以上結(jié)果表明PIF4主要參與了MeJA誘導(dǎo)的花青素積累。

花青素積累是植物為適應(yīng)缺氮環(huán)境而進(jìn)化出的一種適應(yīng)性反應(yīng)。圖 1 D 表明，在缺氮條件下， pif4-2和pif5-2中的花青素含量高于 Col-0 中的花青素含量。pif4-2和pif5-2分別增加了約 64.9% 和 34.9% 。它們的過表達(dá)菌株（35S::PIF4和35S::PIF5）在-N條件下表現(xiàn)出相反的趨勢。相比之下，在-N條件下， pif3-1、Col-0和35S::PIF3的花青素含量沒有差異（圖1D）。此外，pifq在所有突變體中花青素含量最多，與Col-0相比增加了約67.1%。這些數(shù)據(jù)表明PIF4和PIF5主要抑制-N條件下花青素的積累。

在NaCl處理下，pif3-1、pif4-2和pif5-3中PIF3、PIF4和PIF5的突變導(dǎo)致花青素有少量積累，分別增加了17.1%、20.5%和32.8%（圖1E )。在pifq中顯著增加了 35.2% 。圖 1E進(jìn)一步表明35S::PIF3和35S::PIF4的花青素含量分別顯著降低了40.9%和84.2% 。然而，在35S::PIF5，花青素含量與Col-0相比無顯著差異。這些結(jié)果表明PIF3和PIF4都主要參與調(diào)節(jié)NaCl誘導(dǎo)的花青素積累。

表型分析表明，與 Col-0 相比，6-BA、MeJA、-N 和 NaCl 處理導(dǎo)致pif4-2中花青素顯著積累，并且這種積累在35S::PIF4幼苗中受到強烈抑制（圖 1 F） . 此外，在所有處理下， pifq比pif4-2和 Col-0積累更多的花青素。此外，還分析了PIFs的轉(zhuǎn)錄，以進(jìn)一步研究PIFs在不同處理下花青素積累中的功能。qRT-PCR 結(jié)果顯示，6-BA、MeJA、-N 和 NaCl 處理導(dǎo)致PIF4表達(dá)顯著降低。相比之下，轉(zhuǎn)錄PIF1、PIF3和PIF5在 6-BA、MeJA、-N 和 NaCl 處理下增加（圖1G ）。綜上所述，上述結(jié)果證實，PIF4作為主要調(diào)節(jié)因子，作為負(fù)調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)6-BA、MeJA、-N和NaCl處理的花青素積累。

3.2 PIF4下調(diào)花青素生物合成和調(diào)控中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄

花青素生物合成是黃酮類生物合成途徑的一個分支，由一系列酶促反應(yīng)組成。通過qRT-PCR分析了參與花色苷生物合成（ UF3GT、CHS、LDOX、DFR）和調(diào)控（EGL3、TT8、TTG1、PAP1 ）的基因的轉(zhuǎn)錄水平。在對照組，突變pif4中的PIF4導(dǎo)致CHS、PAP1和TTG1的下調(diào)和UF3GT、TT8和EGL3的上調(diào)（圖2A ）。然而， UF3GT和TTG1的相對表達(dá)水平在pifq中增加（分別增加135.1% 和 99.49%）。相比之下，在 pifq 中，CHS、LDOX和PAP1的轉(zhuǎn)錄分別減少了 157.1%、254.9% 和 317.5% 。

UF3GT、LDOX、PAP1、TT8、TTG1和EGL3的轉(zhuǎn)錄顯著增加（在pif4中分別增加 324.1%、122.5%、258.2%、190.0%、192.3% 和 104.2%和 632.3%、319.4%在pif4和pifq突變體中 6-BA 處理后，分別為494.5 %、408.0%、239.6% 和 122.6%（圖2B ）。另一方面，顯著下調(diào)LDOX、CHS、UF3GT、DFR、PAP1、TTG1的轉(zhuǎn)錄, TT8和EGL3在35S::PIF4中觀察到；特別是對于DFR、LDOX和EGL3；它們的表達(dá)分別減少了 70.2%、67.1% 和 75.4%（圖2B）。圖2C 顯示，與在 MeJA 處理 12 小時下的 Col-0 進(jìn)行比較，TT8、UF3GT、PAP1和DFR的轉(zhuǎn)錄在pif4-2 和pifq中顯著增加。正如預(yù)期的那樣，花青素生物合成基因（CHS、DFR、LDOX、UF3GT ）和調(diào)節(jié)基因（PAP1、TT8、TTG1、EGL3 ）的相對表達(dá)水平在35S::PIF4中大大下調(diào)?；ㄇ嗨卣{(diào)控基因（PAP1、TTG1、TT8、EGL3）和生物合成基因（CHS、LDOX、DFR、UF3GT ）的表達(dá)一致（圖 2 D）。此外，與 Col-0 相比，35S::PIF4幼苗的NaCl 處理導(dǎo)致pif4中花青素生物合成和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄顯著增加。在花青素合成和調(diào)控基因中，除EGL3外，其他所有基因的轉(zhuǎn)錄在pifq幼苗中均顯著上調(diào)?；ㄇ嗨厣锖铣苫颍↙DOX、DFR、CHS和UF3GT）和調(diào)控基因顯著下調(diào)。（圖 2 E）。

值得注意的是，上述基因的表達(dá)在pif4和pifq幼苗中均上調(diào)，但在 6-BA、MeJA、-N 和 NaCl 處理下的35S::PIF4中下調(diào)（圖 2）。這些結(jié)果表明PIF4通過抑制花青素生物合成和調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控花青素的積累。

3.3 PIF4 與 PAP1 相互作用

為了尋找PIF4的直接靶基因，通過酵母雙雜交（Y2H）技術(shù)篩選和分析了幾個在花青素調(diào)控中起關(guān)鍵作用的基因，包括PAP1、GL3、TT8和MYB12 。Y2H 分析表明 PIF4 與 PAP1 蛋白相互作用（圖 3A）。我們還測試了 PIF1、3 和 5 在酵母中與 PAP1 的相互作用。結(jié)果表明，PIF1、PIF3 和 PIF5 不與 PAP1 相互作用（圖3B）。PIF4 具有 N 端活性光敏色素結(jié)合 (APB) 基序 ( Khanna et al., 2004 ) 和 C 端bHLH結(jié)構(gòu)域 ( Duek et al., 2004）。我們通過 Y2H 測定繪制了與 PAP1 相互作用的 PIF4 區(qū)域（圖 3C）。這些結(jié)果證實了 PIF4 的 N 端結(jié)構(gòu)域與 PAP1 相互作用，但 PIF4 的 C 端結(jié)構(gòu)域沒有（圖3D）。這表明PIF4蛋白的APB結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑IF4和PAP1之間的相互作用是必不可少的。

3.4 PIF4與PAP1基因相互作用以調(diào)節(jié)花青素生物合成

為了驗證PIF4和PAP1之間的相互作用，我們在 Col-0 背景中構(gòu)建了PAP1 ( 35S::PAP1 ) 的過表達(dá)系。然后，我們通過將PIF4-OX與35S::PAP1或pap1-1D突變體交叉產(chǎn)生35S::PAP1/35S::PIF4和pap1-1D/35S::PIF4系。qRT-PCR 和半定量 PCR (RT-PCR) 分析證實PAP1確實在35S::PAP1轉(zhuǎn)基因系中過表達(dá)（圖 6 A 和 B）。PAP1在35S::PAP1/35S::PIF4中的轉(zhuǎn)錄低于在35S::PAP1和pap1-D (圖 6A ) 。有趣的是，不同轉(zhuǎn)基因品系在濾代過程中的種皮顏色存在顯著差異。結(jié)果表明，35S::PAP1-5和35S::PAP1-8種子呈深棕色，但35S::PAP1/35S::PIF4種子的黃色比35S::PAP1種子淺得多（圖 6）C），表明由于PIF4的過表達(dá)，種子中的花青素含量降低。表型分析結(jié)果進(jìn)一步證實，與35S::PAP1-5、35S ::PAP1-8或pap1-1D相比，35S::PAP1/35S::PIF4幼苗沒有明顯的花青素積累（圖6D ）。接下來，我們測量了正常條件下不同品系的花青素含量。35S::PAP1和pap1-D中的花青素含量比Col-0分別增加了432.3%和398.4%。此外， 35S::PAP1/35S::PIF4和pap1-D/35S::PIF4之間的花青素含量和35S::PIF4幼苗沒有明顯差異（圖 6 E）。

3.5 不同條件下轉(zhuǎn)基因植物花青素的積累

為進(jìn)一步探討擬南芥PIF4與PAP1的關(guān)系，測定了不同處理下幼苗的花青素含量。我們發(fā)現(xiàn)，在 6-BA 和 MeJA 處理下，與 Col-0 相比，35S::PAP1和pap1-1D播種中積累了更多的花青素。35S::PAP1和pap1-1D中的花青素含量在6-BA 處理下分別增加了 556.8% 和 559.3%，在 MeJA 處理下分別增加了 376.8% 和 459.3%（圖 7 A 和 B）。然而，在35S::PIF4、pap1-D/35S::PIF4的幼苗中僅檢測到同樣低的花青素含量和35S::PAP1/35S::PIF4。在–N 和 NaCl 處理下獲得了類似的結(jié)果（圖 7 B）。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，PIF4 的過表達(dá)抑制了pap1-D和35S::PAP1植物中花青素的積累。

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結(jié)論

在 6-BA、MeJA、-N 和 NaCl 處理下，植物的PIF4轉(zhuǎn)錄水平較低。同時，PIF4與PAP1結(jié)合并干擾MBW蛋白復(fù)合物，從而抑制花青素的積累?？傊?，我們的研究與其他研究一起表明，PIF4 通過多種復(fù)雜的機制負(fù)調(diào)節(jié)花青素水平。

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獲取原文

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https://www./science/article/pii/S0176161721001978?via%3Dihub

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