簡介
哺乳動物表達系統(tǒng)的突出優(yōu)點是表達蛋白可正確折疊以及進行糖基化等翻譯后修飾，表達產(chǎn)物具有生物活性，已成為表達和生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物，基因工程抗體，疫苗抗原和研究用目的蛋白功能的首選表達體系。
哺乳動物表達體系蛋白表達的主要流程為：
PCR擴增目的片段——將基因片段克隆到表達載體上——細胞轉(zhuǎn)染——細胞株的篩選和培養(yǎng)——純化目的蛋白

解決方案
1、查找目的基因序列
由于引物是根據(jù)目的基因序列來設(shè)計的，所以查找到目的基因序列是設(shè)計引物的第一步。查找目的基因序列可以在多個網(wǎng)站上查到，也可以在文獻中查找。
這里介紹的是比較常用的NCBI網(wǎng)站查找基因序列的方法。NCBI是美國國家生物技術(shù)信息中心，網(wǎng)站上具有多個生物數(shù)據(jù)庫，是生物學(xué)研究常用的網(wǎng)站。

1.1打開NCBI網(wǎng)站，在下拉框選擇Gene，輸入目的蛋白名稱；（這里以p65為例）

1.2 找到對應(yīng)物種，也可以選擇右側(cè)框中的物種查找；

1.3 頁面往下拉，找到mRNA and Protein(s)，選擇正確的isoform，NMxxx表示mRNA序列，NPxxx表示蛋白質(zhì)序列；

1.4 新頁面往下拉，點擊CDS，點擊右側(cè)FASTA，即可得到目的基因的mRNA序列，復(fù)制粘貼到新的文本，以備使用。

2、選擇合適的表達載體

常用的真核表達載體有pCMV，pcDNA等。表達載體一般包括啟動子，多克隆位點，抗性基因，標(biāo)簽基因等等。

表達載體的選擇原則：
1）啟動子是否為真核啟動子；
2）標(biāo)簽基因是否是我們需要用的標(biāo)簽。
常用的標(biāo)簽的標(biāo)簽有His，GST，MBP，Strep，F(xiàn)lag標(biāo)簽等，標(biāo)簽選擇如下：

3、設(shè)計引物
設(shè)計引物也有多個軟件可以使用，這里介紹的是常用的Primer 5軟件。
設(shè)計引物的基本原則是：
1）引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp；
2）引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3）引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右；
4）3'端最好不要是連續(xù)堿基，GGG或CCC會導(dǎo)致錯誤的引發(fā)，同時3'端最后一個堿基最好不要是A或T，否則容易導(dǎo)致錯配；
5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5計算Tm值，也就是退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內(nèi)；
6）在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩(wěn)定（GC含量多），而3'端不穩(wěn)定（AT含量多）的引物，這種引物的結(jié)構(gòu)可以有效地消除假引發(fā)反應(yīng)；
7）引物和產(chǎn)物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內(nèi)最好。

此外，在引物的兩端需要加上酶切位點和保護堿基。為了保證基因序列的方向性，并且防止自連，現(xiàn)在基本上都選擇雙酶切位點。酶切位點的選擇原則：
1）酶切位點存在于載體上，不存在于基因序列中；
2）兩個酶最好有共同的緩沖體系；
3）兩個酶在載體上酶切位點位置不能太近。
如果載體上沒有標(biāo)簽序列，還需要在引物設(shè)計時加上標(biāo)簽序列。

如何確定酶切位點
3.1 打開Primer 5，選擇file - new -DNAsequence，輸入上述保存的CDS序列，點擊As Is；

3.2 點擊左側(cè)Enzyme框，看一下載體上選擇的雙酶切位點是否在右側(cè)框中，如果不在，從左側(cè)框中添加到右側(cè)框中；

3.3 點擊OK即可查看CDS序列中有無選定的酶切位點，如果選定的雙酶切位點存在于目的蛋白的CDS序列中，需重新選擇雙酶切位點。

如何設(shè)計引物
3.4 打開Prime 5軟件，點擊File——New——DNA Sequence

3.5 點擊空白處粘貼我們之前找好的目的基因的CDS序列，選擇As is。

3.6 點擊左上角的Primer，S為正向引物，A為反向引物

3.7 點擊Edit Primers編輯序列，可調(diào)整引物長短，添加酶切位點序列以及保護堿基。如果顯示Hairpin，Dimer，F(xiàn)alse Priming，Cross Dimer或者Tm值太高或太低，則需要調(diào)整。

如果檢測引物特異性
3.8 NCBI主頁最下端找到Primer-BLAST，打開；

3.9 輸入上下游引物序列，點擊最下方

；

3.10 如果只能檢測到你的目的蛋白基因，則表明特異性較好。

拿到合成的引物之后，我們就可以進行目的基因的擴增了。合成目的基因通常是以目標(biāo)物種的基因組為模板。
由于真核生物的基因組中存在內(nèi)含子序列，在mRNA的剪接加工過程中被切除，因此，在構(gòu)建真核基因克隆時基因組DNA不能直接用作PCR擴增的模板，只能從細胞或者組織中提取總RNA或者mRNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板通過PCR擴增目的基因。

4、從細胞中提取總RNA
4.1 從細胞培養(yǎng)箱中取出已經(jīng)長滿細胞的細胞培養(yǎng)皿，小心吸出培養(yǎng)基，加入4ml預(yù)冷PBS，傾斜細胞培養(yǎng)皿3次以充分洗滌細胞，然后小心吸盡PBS溶液。
4.2 培養(yǎng)皿中加入1ml Trizol試劑裂解細胞，冰上靜置5min，槍頭吹打，室溫靜置5min；
4.3 將細胞裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2 ml，震蕩儀震蕩15s。
4.4 室溫靜置2-3min，12000xg，4℃，15min離心。
4.5 離心后液體分為三層（上層無色為RNA，中層為DNA，底層為蛋白質(zhì)），小心吸取上層無色液體至新的EP管中。
4.6 加入等體積異丙醇，混勻，冰上靜置10min，12000xg，4℃，10min離心。
4.7 此時在管底可見RNA白色沉淀，棄去上清。
4.8 加入75%乙醇1ml，震蕩儀震蕩30s，7500xg，4℃，5min離心。
4.9 小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風(fēng)靜置干燥3-5min。
4.10 加入20ul DEPC水溶解。水浴或者加熱器55-60℃，10-15min。
4.11 測定純度和濃度。吸光度A260/280比值接近2表明純度較高。
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5、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
反轉(zhuǎn)錄通常使用試劑盒和PCR儀器進行操作，這里參照了愛必信的RT-PCR Kit產(chǎn)品說明書進行介紹。
產(chǎn)品組分：

實驗方法：
5.1 將 RNA 模板、引物、2×One-Step RT-PCR SuperMix，RT Enzyme Mix 和RNase Free Water 溶解并置于冰上備用。
5.2 配置以下反應(yīng)體系：

5.3 輕輕混勻后短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
5.4 常用反應(yīng)程序：

5.5 反應(yīng)完成后，測定純度和濃度。
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6、目的基因的擴增
目的基因的擴增通常也是使用試劑盒和PCR儀器完成。這里參照了愛必信的2xPfu Master Mix產(chǎn)品說明書進行介紹。
注：所有組分應(yīng)仔細混勻并離心后開啟，所有 PCR操作過程應(yīng)在冰上進行。
操作示例：以50 μl PCR反應(yīng)體系為例 。
6.1 按照下表配制 PCR反應(yīng)體系

*模板量：1-2 μl RT-PCR反應(yīng)后的 cDNA。
6.2 PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置

6.3 結(jié)果檢測：取 2-5 μl反應(yīng)液電泳觀察結(jié)果，測定純度和濃度。

目的基因擴增之后，就要將目的基因和表達載體連接在一起。通常使用酶切連接的方法，將目的基因和表達載體分別用同樣的兩個限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，得到互補的酶切位點，然后用T4連接酶將這兩部分連接在一起。目的基因擴增之后，目的基因存在的緩沖體系可能會影響到酶切效果，所以通常先進行目的基因的純化，也叫作切膠回收。

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7、目的基因的純化
先進行跑膠，然后進行切膠回收。切膠回收通常也使用試劑盒進行操作，這里參照愛必信的DNA Gel/PCR Purification Kit產(chǎn)品說明書進行介紹。
7.1 取50xTAE緩沖液20ml加水至1000ml，配制成1xTAE電泳緩沖液，備用。
7.2 稱取0.5g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml 1xTAE電泳緩沖液，在微波爐里加熱至瓊脂糖全部融化，取出搖勻。加熱過程中要不時搖動，使瓊脂糖在溶液中分散均勻。
7.3 在制膠槽中插好梳子，向冷卻的瓊脂糖中加入GelRED染色劑，緩慢倒入制膠槽中。把制膠槽放入電泳儀中，在電泳儀中倒入TAE電泳緩沖液。
7.4 將50ul PCR產(chǎn)物中加入10ul 6x loading buffer并混勻，用移液器小心加入到加樣孔中。在旁邊的孔中加入核酸Marker。
7.5 加樣完成后，蓋上電泳儀蓋子，啟動電源。電壓通常設(shè)置為100V，當(dāng)溴酚藍指示跑到適合位置時，關(guān)閉電源停止電泳。
7.6 將凝膠轉(zhuǎn)移至核酸檢測儀中，在紫外燈下快速準(zhǔn)確的切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，放進1.5ml離心管中。
以下為愛必信DNA Gel/PCR Purification Kit產(chǎn)品說明書進行膠回收介紹。
產(chǎn)品組分：

7.7 DNA吸附柱平衡處理：向Gel Recovery Column中加入200μl buffer CBS，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將Gel Recovery Column重新放回到收集管中。再向Gel Recovery Column中加入200μl的ddH2O，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。將Gel Recovery Column重新放回到收集管中。
7.8 從瓊脂糖凝膠中切下含有目的片段的凝膠，估計重量或精確稱量重量。每100mg 1%瓊脂糖凝膠加入100μl Binding Solution。
7.9 于50-60℃水浴5-10min，期間每2-3min間斷輕微顛倒混勻，直至膠塊完全融化。
7.10 于50-60℃水浴5-10min，期間每2-3min間斷輕微顛倒混勻，直至膠塊完全融化。
7.11 將吸附柱重新放回收集管中，加入500μl WA Solution，于12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液。
7.12 將吸附柱重新放回收集管中，加入500μl Wash Solution，于12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液。
7.13 重復(fù)上個步驟一次。
7.14 將吸附柱重新放回收集管中，12000rpm離心1min，打開吸附柱蓋子，室溫放置5-10min或50℃放置3-5min，以徹底去除Wash Solution。
7.15 將吸附柱放入干凈的1.5ml收集管中（試劑盒自帶），對于膜中央懸空加入30-50μl Elution Buffer，蓋好蓋子，37℃放置2min，12000rpm離心1min，離心管中的液體即為包含目的基因的溶液。
7.16 檢測純度及濃度。

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8、目的基因和表達載體的雙酶切
酶切操作建議參考購買的限制性內(nèi)切酶的使用說明書，這里介紹常規(guī)方法。
8.1 在兩個PCR管中分別混合以下成分：
表達載體酶切：

PCR產(chǎn)物酶切：

8.2 輕彈管壁混勻，短暫離心。
8.3 放入PCR儀中，37℃，3h。
8.4 跑電泳進行膠回收。

9、目的片段和表達載體的連接
9.1 取PCR管，加入酶切后的表達載體片段2ul，酶切后的目的基因片段6ul，T4 DNA連接酶1ul，10* T4 buffer 1ul，輕彈管壁混勻，短暫離心。
9.2 放入PCR儀中，16℃過夜。

目的基因與載體的連接反應(yīng)中，存在多種可能的連接方式，除了正確連接外，也可能出現(xiàn)載體和載體連接，目的基因和目的基因連接，或者部分連接的情況，因此需要把正確連接的重組質(zhì)粒篩選出來。通常將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，通過菌落PCR或者酶切鑒定的方法篩選出陽性克隆株，然后送到測序公司進行測序。測序準(zhǔn)確的陽性克隆株就可以進行大量擴增和保存。
常用的大腸桿菌感受態(tài)細胞為DH5α或者TOP10。
10.1 取出感受態(tài)大腸桿菌，放于冰上使其慢慢融化。
10.2 將連接產(chǎn)物加入100ul感受態(tài)大腸桿菌中，輕輕混勻，冰上孵育30分鐘。
10.3 將EP管放入42℃水浴箱中熱激90秒，再迅速放于冰上2分鐘。
10.4 EP管中加入400u LB培養(yǎng)基，置于搖床上，37℃，500rpm培養(yǎng)45分鐘。
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11、涂板培養(yǎng)
500rpm離心1-2分鐘，留100ul培養(yǎng)基上清，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌輕輕混勻，涂于含抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。

12、挑克隆及陽性克隆株鑒定
挑取3-5個單克隆分別放入不同的離心管中（如果菌落不多可以全部挑取），此時可以進行菌落PCR和酶切鑒定。
1）菌落PCR
同質(zhì)粒構(gòu)建時的PCR擴增，使用同樣的引物，模板換成挑出的菌落；跑膠如果有擴增的條帶則為陽性克隆株；
2）酶切鑒定
菌落提質(zhì)粒，使用質(zhì)粒構(gòu)建時的酶進行酶切；跑膠如果看到目的片段則為陽性克隆株；

13、質(zhì)粒提取
酶切鑒定需要提質(zhì)粒，如果直接送公司測序，此步也可省略。提取質(zhì)粒一般也是使用試劑盒進行操作，這里參照愛必信的質(zhì)粒小量快速提取試劑盒產(chǎn)品說明書進行介紹。
產(chǎn)品組份：

實驗方法：
13.1 向吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中）加 500μl 的平衡液 BL，12,000rpm 離心1min， 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
13.2 取 1.5-4.5 毫升過夜培養(yǎng)的菌液 12,000rpm 離心 30sec，盡可能的倒干上清，收集菌體。
13.3 用 250μl 溶液 P1 重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。
13.4 加 250μl 溶液 P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次（裂解時間不超過 5min）使菌體充分裂解。
13.5 加 350μl 溶液 P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn) 4 -7 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12,000rpm 離心 5 min。
13.6 將上清加入到過濾柱E中（過濾柱放入 1.5ml或2ml離心管中），12,000rpm離心2 min，收集液體。如上清量較大，請分兩次離心。
13.7 將上述液體轉(zhuǎn)入吸附柱 AC 中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm 離心 30-60 sec，倒掉管中的廢液。 可選步驟: 所用菌株為 JM 系列、HB101 等 endA 菌株或野生型菌株時，由于核酸酶含量豐富， 應(yīng)加入 500μl 去蛋白液 PD，12,000rpm 離心 30-60 sec，棄廢液。
13.8 加入 500μl 漂洗液 WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心 30-60sec 棄掉廢液。
13.9 重復(fù)上個步驟。
13.10 將吸附柱 AC 放回空收集管中，12,000rpm 離心 2 min，將吸附柱置于室溫放置數(shù)min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
13.11 取出吸附柱 AC，放入一個干凈的離心管中，室溫放幾分鐘。
13.12 在吸附膜的中間部位加 50μl-100μl 洗脫緩沖液 EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置 2 min，12,000rpm 離心 1 min。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心 1 min。(注意：若用 ddH2O 做洗脫液，應(yīng)保證其 pH 值在 7.0-8.5 范圍內(nèi)，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于 50 μl，體積過小影響回收效率。且 DNA 產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防 DNA 降解。)
14、測序
鑒定后的陽性克隆株進行培養(yǎng)，送公司測序。測序成功的菌株進行培養(yǎng)和保存。

15、目的蛋白的表達
目的蛋白表達通常使用293細胞或者CHO細胞。將鑒定成功后的克隆株培養(yǎng)之后，提取重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中。提質(zhì)?？蓞⒖记拔牟襟E。
15.1 細胞復(fù)蘇
在無菌超凈臺中預(yù)備培養(yǎng)瓶，加5ml預(yù)熱培養(yǎng)基，蓋好瓶蓋待用。將細胞從液氮中取出，置于37℃水浴中迅速解凍，用酒精棉球擦拭后移至超凈工作臺，（如果需要去除冷凍保護劑，例如DMSO或Glycerol，則先800rpm離心3min，吸出冷凍保護劑），加入少量培養(yǎng)基吹打并混勻細胞，吸入至培養(yǎng)瓶中。

15.2 細胞傳代
1、取出細胞培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)基，加1ml PBS潤洗細胞，吸出PBS丟棄；
2、加入1ml胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使浸潤所有細胞，放入37℃培養(yǎng)箱中；
3、加入2ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞使細胞脫落；
4、收集細胞懸液至離心管中，1200rpm離心3min，吸出上清；
5、加入新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻，分別加入到兩個培養(yǎng)瓶中。
注：如果是懸浮細胞，則無需消化步驟。

15.3 細胞計數(shù)
1、使用胰酶消化細胞，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。
2、如果需要查看細胞活性，可使用臺盼藍染色。取180ul的細胞液至EP管中，加入20ul臺盼藍母液（4%臺盼藍）,用移液器吹打混勻；
3、取10ul含有臺盼藍的細胞液加入細胞計數(shù)器中，使用顯微鏡進行細胞計數(shù)。

15.4 細胞轉(zhuǎn)染
細胞轉(zhuǎn)染常用的方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，電穿孔轉(zhuǎn)染法，病毒轉(zhuǎn)染法等等，這里以Polyplus的JetPRIME轉(zhuǎn)染試劑為例進行介紹。
1、為了達到最好的轉(zhuǎn)染狀態(tài)，一般選擇細胞融合度為60%-80%時進行轉(zhuǎn)染。推薦的細胞數(shù)可以參考以下表格：

2、稀釋X ug的質(zhì)粒至W ul的JetPRIME緩沖液中，震蕩10s，瞬離；
3、加入Y ul JetPRIME試劑至上一步的混合物中；
4、震蕩1s，瞬離，室溫孵育10min；
5、把轉(zhuǎn)染混合物加至細胞培養(yǎng)瓶中。
具體體積參考下表：

15.5 蛋白檢測
取細胞加裂解液進行細胞裂解，取部分上清和6xloading buffer混合，在95℃加熱5min。使用SDS-PAGE進行跑膠并用考馬斯亮藍 R250進行染色，檢測蛋白表達。

16、蛋白純化
成功表達目標(biāo)蛋白的細胞經(jīng)過裂解，超聲和過濾后可開始進行蛋白純化。標(biāo)簽蛋白純化通常使用2步或者3步純化方式。

16.1 標(biāo)簽親和層析
根據(jù)您構(gòu)建質(zhì)粒時選擇的標(biāo)簽選擇對應(yīng)的標(biāo)簽親和層析產(chǎn)品。常用的標(biāo)簽有HIS，GST，MBP，Strep，F(xiàn)LAG等等，這里以His標(biāo)簽預(yù)裝柱和重力柱為例進行介紹。
（一） HisTrap HP 預(yù)裝柱使用說明
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
樣品上樣前需要過濾，緩沖液需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。
1、 系統(tǒng)設(shè)置一個低流速， 移除預(yù)裝柱頂部的堵頭，把柱子連接到 ?KTA 純化儀的接頭上，注意要液滴對液滴進行連接，防止引入氣泡。
2、 去除柱子底部的堵頭，連接到純化儀上。
3、 用 3-5 個柱體積的蒸餾水洗去乙醇。
4、 用 5 個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，建議流速是 1ml/min（1ml 體積柱子）和 5ml/min（5ml 體積柱子）。
5、 用上樣環(huán)或者 superloop 加入預(yù)處理的樣品（樣品在上柱前一定要進行離心和過濾），在上樣時建議流速為 0.2-1ml/min（1ml 體積柱子）和 0.5-5ml/min（5ml 體積柱子）。
6、 用結(jié)合緩沖液洗滌至少 10 到 15 個柱體積，直到吸收峰達到穩(wěn)定基線或在流出物中沒有物質(zhì)流出。洗滌過程中建議保持流速為 1-2ml/min（1ml 體積柱子）和 5-10ml/min（5ml體積柱子）。
7、 用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（拉咪唑濃度梯度）。一步洗脫通常 5 個柱體積，線性洗脫通常 10-20 個柱體積。在洗脫過程中保持流速為 1-2ml/min（1ml 體積柱子）和 5-10ml/min（5ml 體積柱子）。
8、 洗脫后，用 3-5 個柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。
Note：如果需要去除純化后樣品中的咪唑，建議使用 HiTrap Desalting 脫鹽柱或者 PD-10 Dealting 脫鹽柱。

（二） Ni Sepharose 6 FF 裝重力柱使用說明
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
樣品上樣前需要過濾，緩沖液需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。
一、 準(zhǔn)備 PD-10 空柱
1、 用 20%的乙醇洗滌濾膜。
2、 用蒸餾水潤洗濾膜。
3、 將濾膜放入 PD-10 空柱。
二、 填料準(zhǔn)備
1、 輕柔震蕩瓶子，直到填料懸濁液均一。
2、 將需要量的填料懸濁液從瓶中轉(zhuǎn)移到離心管中。
3、 用 500xg 離心 5min 以沉淀填料。
4、 除去上清，加入適量蒸餾水。
5、 輕柔的振蕩填料懸濁液 3min， 用 500xg 離心 5min。
6、 除去上清，加入適量結(jié)合緩沖液，重復(fù)步驟 5.
7、 把填料懸濁液轉(zhuǎn)移到量筒中。
8、 加入適量體積的結(jié)合緩沖液，使懸濁液中的填料濃度達到 50%。
三、 重力柱純化
1、 將樣品加入含有 50%填料的懸濁液中（樣品在上柱前要進行離心和過濾）。 Ni Sepharose 6FF 的平均載量是 40mg/ml。則 1ml 的 50%懸濁液的載量為大約 20mg 蛋白。
2、 將樣品和填料混合物在搖床上低速混合 1h。
3、 將樣品和填料混合物加入到 PD-10 的空柱中，收集流出物。
4、 用結(jié)合緩沖液洗滌 2-5 個柱體積，收集流出物。
5、 用 4 個柱體積的洗脫緩沖液洗脫，收集流出物。

16.2 離子交換
離子交換需要根據(jù)您蛋白的等電點選擇陰離子交換柱或者陽離子交換柱。
1、如果您的蛋白的等電點小于緩沖液的PH，則選擇陰離子交換柱（Q，DEAE）；
2、如果您的蛋白的等電點大于緩沖液的PH，則選擇陽離子交換柱（S，SP，CM）；
這里以Q柱為例進行介紹。

結(jié)合緩沖液：緩沖液的PH比目標(biāo)蛋白的等電點高一個PH。
推薦緩沖液：

洗脫緩沖液：結(jié)合緩沖液+1M NaCl
樣品上樣前需要過濾，置換到結(jié)合緩沖液中。緩沖液需要預(yù)先過濾和超聲去除氣泡。

1、 系統(tǒng)設(shè)置一個低流速， 移除預(yù)裝柱頂部的堵頭，把柱子連接到 ?KTA 純化儀的接頭上，注意要液滴對液滴進行連接，防止引入氣泡。
2、 去除柱子底部的堵頭，連接到純化儀上。
3、 用 3-5 個柱體積的蒸餾水洗去乙醇。
4、 用 5 個柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，建議流速是 1ml/min（1ml 體積柱子）和 5ml/min（5ml 體積柱子）。
5、 用上樣環(huán)或者 superloop 加入預(yù)處理的樣品（樣品在上柱前一定要進行離心和過濾），在上樣時建議流速為 1ml/min（1ml 體積柱子）和 5ml/min（5ml 體積柱子）。
6、 用結(jié)合緩沖液洗滌至少 5個柱體積，直到吸收峰達到穩(wěn)定基線或在流出物中沒有物質(zhì)流出。洗滌過程中建議保持流速為 1ml/min（1ml 體積柱子）和 5ml/min（5ml體積柱子）。
7、 用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（拉NaCl梯度）。一步洗脫通常 5-10 個柱體積，線性洗脫通常 10-20 個柱體積。在洗脫過程中保持流速為 1ml/min（1ml 體積柱子）和 5ml/min（5ml 體積柱子）。
8、 洗脫后，使用5個柱體積結(jié)合緩沖液+1M NaCl進行再生，然后用 5-10 個柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。

16.3 凝膠過濾層析
凝膠過濾層析主要用于精細純化或者去除多聚體。凝膠過濾層析主要根據(jù)上樣量和蛋白分子量進行選擇。
這里以Superdex 200 Increase 10/300為例進行介紹。

緩沖液的選擇：
緩沖液可以根據(jù)您的樣品或者下游應(yīng)用進行選擇，由于在極低鹽濃度的情況下，酸性和堿性蛋白質(zhì)都可能發(fā)生離子相互作用，因此推薦的緩沖液是 0.01 至 0.05 M 磷酸鈉再加上0.15 M NaCl，pH 7.4。

樣品處理：
分子量：10KD-600KD
上樣體積：25-500ul
蛋白濃度：樣品中最多50 mg/mL，在低于10 mg/mL時可獲得更高的分辨率。
準(zhǔn)備：將樣品溶解在緩沖液中，10 000 g 離心10 分鐘，用0.22 μm 過濾器過濾。

1、根據(jù)層析柱的耐壓在系統(tǒng)中設(shè)置柱前壓和delta壓
2、系統(tǒng)設(shè)置一個低流速， 移除預(yù)裝柱頂部的堵頭，把柱子連接到 ?KTA 純化儀的接頭上，
注意要液滴對液滴進行連接，防止引入氣泡。
3、去除柱子底部的堵頭，連接到純化儀上。
4、以0.75 mL/min 的流速使用至少 2 個柱體積 (CV) 的室溫去離子水進行平衡。
5、以0.75 mL/min 的流速用至少 2 個柱體積 (CV) 緩沖液平衡層析柱。
6、以0.75 mL/min 的流速進行上樣和緩沖液洗脫。
7、純化結(jié)束后，用2CV的去離子水清洗柱子，然后填充20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。

17、跑膠鑒定
純化后的蛋白大小和純度鑒定可用SDS-PAGE跑膠進行鑒定。
17.1 配膠：拿出電泳儀的制膠架，干凈的玻璃板，夾緊玻璃板。先配制下層的分離膠。
用燒杯或者錐形瓶按照以下配方進行配制。

搖勻，用移液槍緩慢加入玻璃板中，注意盡量不要產(chǎn)生氣泡。用1ml無水乙醇或者蒸餾水，壓在分離膠上面。待分離膠凝固后，倒出上層的無水乙醇或者水，用濾紙吸干。按照以下配方配制上層濃縮膠。

搖勻，用移液槍緩慢加入玻璃板中，注意盡量不要產(chǎn)生氣泡。插入梳子。
17.2 上樣
把制備好的凝膠從制膠架上取下來，放入電泳槽中。電泳槽加入電泳緩沖液。取部分樣品和6xloading buffer混合，在95℃加熱5min。拔出膠上的梳子，把樣品加到梳孔中。在旁邊的孔中加上蛋白Marker。
電泳緩沖液配方：

17.3 跑膠
蓋上電泳儀蓋子，插上電源。可以先用80V跑膠，當(dāng)樣品跑入分離膠后，可用220V跑膠。溴酚藍跑到比較靠下的位置，停止跑膠。
17.4 染色
可用考馬斯亮藍R250進行凝膠染色。這里以愛必信的考馬斯亮藍R250產(chǎn)品說明進行介紹。
（1）電泳結(jié)束后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠。
（2）置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動，室溫染色 1h 或更長時間。
注：具體的染色時間取決于凝膠的厚度和染色時的溫度。凝膠較厚，溫度較低，則染色時間宜適當(dāng)延長。凝膠較薄，溫度較高，則染色時間可以適當(dāng)縮短。通常染色至凝膠的顏色和染色液的顏色非常接近，在染色液中幾乎看不清凝膠時，可以認為已染色充分。
（3）倒出染色液。染色液可以回收重復(fù)使用至少 2-3 次。
（4）加入適量考馬斯亮藍染色脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠。
（5）置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動，室溫脫色 4-24h。期間更換脫色液 2-4 次，直至藍色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達到預(yù)期。通常蛋白條帶在脫色 1-2h 后即可出現(xiàn)。
注：脫色時間過長也會導(dǎo)致蛋白條帶的顏色變淺。
（6）完成脫色后，進行觀察和拍照。