一、引物設(shè)計

1.選擇合適的載體。酶切位點及其順序（酶切位點的順序一定不能顛倒）。

2.在NCBI上再次確認(rèn)目的片段的堿基序列。

①. 使用word排除目的片段里含有的酶切位點，最后確定所使用的酶。

②. 設(shè)計引物：

primer-up：保護(hù)堿基4個,上游酶切位點,首位20個堿基;

Primer-down：保護(hù)堿基4個,下游酶切位點,末尾20個堿基的反向互補堿基;

③. 核對----送去合成。

④. 對合成的引物離心，10000rpm、5-10min、 4℃，在超凈臺按照管子上標(biāo)注的體積加入高壓水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起， 4℃保存。

二、 PCR（P出目的片段）

（一）、從菌液里P出目的片段：

1，揺菌過夜。

15ml離心管：2ul實驗室菌液，Xul相應(yīng)的抗生素，3ml LB

2,pcr。

Pcr(50ul)反應(yīng)體系：菌液1ul，2x PFU mix 25ul ，Primer 1ul；2d H2O 23ul。

Pcr溫度體系：94℃ 30sec，94℃ 30sec 33cycles， 58℃ 30sec 33cycles，72℃ X min；72℃ 5min。

（X是根據(jù)片段的長度設(shè)定，500-1000bp/min，退火溫度根據(jù)Tm值來計算，一般低于Tm值2℃）

3，跑膠、回收。

（1），配膠：

1%的瓊脂糖膠大塊：稱0.6g的瓊脂糖，加入60ml的1X TAE，加入0.6ul的EB(待溫度降到50-60℃左右時)煮沸3次；25分鐘后，即可點樣跑膠。

（2），跑膠：130-150V、25-30分鐘左右。

（3），紫外燈下觀察，切膠（要帶防護(hù)手套和口罩）

4，做膠回收（天根{TIANGEN}公司的DNA純化回收試劑盒）:

按照試劑盒的protocol來做，在膠回收的最后一步，Elution Buffer預(yù)先在55-65℃溫箱中水浴，并且在加過EB后，放在37℃溫箱中2min。

對膠回收的產(chǎn)物跑膠驗證?？山?0ul的體系：回收產(chǎn)物2ul、10xloading buffer 2ul、2d H2O 6ul。

三、 酶切、鏈接

1，目的片段酶切：（37℃酶切過夜或者4小時）

50ul的體系 ：insert ：上述膠回收產(chǎn)物 35ul， 10 x H buffer（1.5x） 7ul， dd H2O 6ul，酶1 1ul，酶2 1ul；

2，載體酶切：（37℃酶切過夜或者4小時）

20ul的體系 ：Vector （1ug/ul）：2 ul，10 x buffer（1.5x） 3ul，dd H2O 13ul， 酶1 1ul，酶2 1ul

為方便以后使用，載體可以一次性多切點。

3， 酶切時，首先要核對一下酶的buffer，有時雙酶切時兩個酶不能共用一種buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切產(chǎn)物回收。

4，連接：

12ul的體系：2x Rapid Ligation 6ul， Vector 0.8ul，insert 4.5ul，T4 DNA Lignase 1ul

四、 轉(zhuǎn)化

感受態(tài)細(xì)菌10ul；質(zhì)粒 10ul

⑴、冰上20分鐘-→熱激：42℃、90秒-→冰上2min

⑵、加1ml SOC（或者1ml LB），37℃、180 rpm、45min。

⑶、將上述轉(zhuǎn)化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：LB=1:1000的比例加入抗生素，（100ml的LB加50ul的2Kx的氨芐）。

⑷、250rpm、過夜。

五、 質(zhì)粒大抽

六、 收菌

取過夜菌至50毫升離心管，離心：6000g、3-5分鐘、4℃。再重復(fù)一次，每管共收集100毫升過夜菌沉淀。（倒置于草紙上使液體流盡)。

七、 重懸

每管加入8ml的RES-EF(RnaseA)，重懸細(xì)菌沉淀—充分Vortex或用槍頭吹打沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團(tuán)塊。

裂解： 每管加入等量的LYS-EF bufffer，即8ml。輕輕上下顛倒離心管4-6次，（勿震?。。┦覝胤胖?min，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明，無團(tuán)塊或絮狀物。

注意：vortex或其它劇烈操作會導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染

平衡：

⑴：濾芯插入柱子，將柱子駕于50ml離心管上（或者直接架于50ml離心管架上）

⑵：取15ml EQU-EF buffer 沿濾芯四周加入—充分平衡濾芯。

注意：①離心管內(nèi)的液體不要浸沒濾柱的頭，所以要勤于倒棄濾液，②在過濾平衡液的同時，進(jìn)行5、6步，防止濾芯干掉。

中和：在等待EQU-EF buffer濾完時，往裂解好的菌液中加入8ml NEU-EF buffer，顛倒混勻，冰上孵育5min。（不能vortex）

離心、過濾：

⑴：離心中和過的菌液：10000rpm、5-10min、at 4℃--質(zhì)粒存在于上清中。

（離心使沉淀更加緊密，更集中于管底，對于進(jìn)一步提高質(zhì)粒質(zhì)量會有所幫助）

⑵：將上清吸入到平衡好的濾芯中,重力自流盡。

洗一：過濾完畢后，吸取5ml的FIL-EF buffer，沿濾芯四周加入（將粘在濾芯上的質(zhì)粒洗下來）--過濾完后，將濾芯棄掉。

洗二：往濾柱中加入35ml的ENDO-EF buffer—去內(nèi)毒素

洗三：待濾完后再加入15ml的wash-EF buffer—過濾。

洗脫：取一支干凈的15ml超速離心管，將濾完的柱子插入到離心管中，用高壓條將二者綁好，往濾柱中加入5ml Elu-EF buffer.

(Elu-EF buffer預(yù)先放在50℃的恒溫箱中加熱，可提高洗脫效率)

沉淀：待Elu-EF buffer濾完后，棄濾柱，往離心管中加入5ml的異丙醇（將質(zhì)粒沉淀下來），混勻（充分vortex），靜止10min---10000rpm、30min、4℃---棄上清。

洗滌：加5ml的70％酒精（ETOH）或用15ml三蒸水（高壓過）+35ml的無水乙醇配制（在超凈臺進(jìn)行），混勻（上下顛倒即可），離心：10000rpm、10min、常溫。

棄上清，重復(fù)上述步驟一次（再洗滌一次）棄上清---到超凈臺用200ul槍頭把上清盡量洗凈----再空離一次，在超凈臺用小槍頭把液體洗凈---吹干。

溶解：取100-300ul高壓過的H2O-EF溶解質(zhì)粒--定量后，將質(zhì)粒的濃度調(diào)至1ug/ul—最后，保存到-20℃。