類器官 VS 組織樣本 VS 動(dòng)物模型

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類器官，CNS期刊的座上賓，一時(shí)聲名鵲起，風(fēng)光無(wú)兩，被各大媒體爭(zhēng)相報(bào)道：

2013年，被Science 雜志評(píng)為年度十大技術(shù)；

2015年，被MIT科技評(píng)論十大科技突破之一；

2018年，被Nature Methods評(píng)為2017年度方法；

2019年，被The New England Journal of Medicine 雜志成為優(yōu)良的臨床前疾病模型。

類器官作為微型體外器官模型，主要來(lái)源于多能干細(xì)胞或成體組織。它們可以自我組織和分化成功能細(xì)胞類型，高度模擬人體內(nèi)器官結(jié)構(gòu)和功能特征。分析類器官的形成可以加深對(duì)人類發(fā)育和組織/器官再生機(jī)制的理解。此外，類器官為疾病建模和藥物篩選提供了強(qiáng)大的平臺(tái)。

類器官技術(shù)，作為近10年來(lái)生物學(xué)界和臨床醫(yī)學(xué)最熱門的前沿技術(shù)之一，備受醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域的關(guān)注，并有望沖刺下一個(gè)諾獎(jiǎng)。

近日，威爾康奈爾醫(yī)學(xué)院陳水冰教授團(tuán)隊(duì)在Nature Methods上發(fā)表觀點(diǎn)文章，概述了人類多能干細(xì)胞衍生的類器官和成體干細(xì)胞衍生的類器官來(lái)研究SARS-CoV-2，宿主反應(yīng)和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的宿主損傷，并進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)和疫苗開(kāi)發(fā)的努力，進(jìn)一步總結(jié)了基于類器官的COVID-19研究中使用的新技術(shù)，以及深入討論了后續(xù)的挑戰(zhàn)。

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初出茅廬

類器官的起源可以追溯到1907年，當(dāng)時(shí)的生物學(xué)家H. V. Wilson試圖在體外再生生物體，并證實(shí)海綿細(xì)胞可以重新組裝和自組織成具有正常功能的新海綿生物體。1965年，在3D細(xì)胞培養(yǎng)研究中，類器官被定義為異常的細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。1975年，萊茵瓦爾德和格林首次描述了長(zhǎng)期培養(yǎng)人類細(xì)胞的方法。隨著3D培養(yǎng)方法的發(fā)展，Emerman和Pitelka通過(guò)懸浮的膠原凝膠培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞。

1981年，首次從小鼠胚胎中分離出胚胎干細(xì)胞（ESC）。1998年，首次從人類囊胚中分離出人胚胎干細(xì)胞，進(jìn)一步推動(dòng)干細(xì)胞生物學(xué)和類器官領(lǐng)域的發(fā)展。2006年，首次從小鼠體細(xì)胞制備得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）。

2008年，Eiraku等人通過(guò)胚胎干細(xì)胞獲得大腦皮層組織。2009年，Sato等人證明Lgr5+的腸道干細(xì)胞可以自組織和分化成隱窩-絨毛類器官。此后，類器官領(lǐng)域研究呈現(xiàn)出爆發(fā)式增長(zhǎng)。

目前，幾乎所有的組織都可以在體外構(gòu)建3D培養(yǎng)的類器官，包括人多能干細(xì)胞來(lái)源的腸道、視網(wǎng)膜、腦、肝、腎、胃、肺、胰腺、結(jié)腸、心臟、和血管類器官和人成體組織來(lái)源的胃、肝、胰腺、胎盤、和肺類器官（圖1）。

圖1：不同類器官類型的建立時(shí)間軸

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大顯身手

類器官已被廣泛地應(yīng)用于模擬人類疾病，包括傳染病。COVID-19是由SARS-CoV-2引起的傳染病，可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），過(guò)度炎癥反應(yīng)和多器官損傷（圖2）。首先，SARS-CoV-2受體是存在于不同類型細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）。ACE2廣泛分布在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，SARS-CoV-2可以通過(guò)呼吸道感染人體并迅速擴(kuò)散到其他器官系統(tǒng)。

因此，COVID-19不僅會(huì)導(dǎo)致呼吸道疾病，還會(huì)誘發(fā)其他器官（包括大腦，心臟，肝臟，腎臟，腸道和胰腺）的損害。

2D細(xì)胞培養(yǎng)模型，已被廣泛用于SARS-CoV-2感染的藥物篩選和機(jī)制研究。但是，2D細(xì)胞培養(yǎng)模型無(wú)法模擬宿主的復(fù)雜性，并且與組織具有不同的表型。相較于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型，3D類器官與人體組織/器官的生理和病理特征具有更高相似性，可以作為研究SARS-CoV-2感染模型，模擬受損器官病理生理學(xué)并進(jìn)行藥物發(fā)現(xiàn)的高級(jí)模型。

圖2：COVID-19患者不同器官系統(tǒng)的并發(fā)癥

▉ 呼吸類器官

在胚胎發(fā)育過(guò)程中，呼吸上皮細(xì)胞來(lái)自內(nèi)胚層，隨后以產(chǎn)生多個(gè)隔室（包括肺泡，近端和中間以及細(xì)支氣管等呼吸道）。SARS-CoV-2主要針對(duì)呼吸系統(tǒng)中的上皮細(xì)胞，引起嚴(yán)重咳嗽，粘液分泌過(guò)多和呼吸急促。嚴(yán)重的COVID-19可發(fā)展為肺炎，進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征，最后發(fā)展為呼吸衰竭。

肺泡、肺氣道和支氣管等類器官已被廣泛用于監(jiān)測(cè)病毒感染、探索病理變化潛在的治療方法。呼吸類器官模型表明，纖毛細(xì)胞、棒狀細(xì)胞和AT2細(xì)胞亞群（分布在氣道和肺泡末端的近端到遠(yuǎn)端）易于受到SARS-CoV-2感染。這些發(fā)現(xiàn)與COVID-19患者尸檢數(shù)據(jù)一致，表明呼吸道類器官模型可以概括體內(nèi)SARS-CoV-2感染。

▉ 腸道類器官

COVID-19患者通常表現(xiàn)出胃腸道癥狀，例如腹瀉、嘔吐或腹痛。人類腸道類器官（IO）已被確定為體外研究腸道病理生理學(xué)的生理相關(guān)模型。腸道類器官包含多種細(xì)胞類型，包括腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞、轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增細(xì)胞和干細(xì)胞。多能干細(xì)胞和成體組織來(lái)源的腸道類器官，包括小腸類器官、結(jié)腸類器官和回腸類器官，已被用于研究SARS-CoV-2感染。

▉ 腎臟類器官

急性腎損傷等腎損傷在COVID-19患者中很常見(jiàn)。人類腎臟類器官（KO）已被應(yīng)用于研究腎臟中的SARS-CoV-2感染。最近一項(xiàng)比較2D和3D腎近端腎小管上皮細(xì)胞中ACE2表達(dá)水平的研究發(fā)現(xiàn)，與2D培養(yǎng)條件相比，KO中ACE2的表達(dá)率高出兩倍，這表明應(yīng)用3D類器官進(jìn)行COVID-19疾病建模的重要性。

▉ 肝臟類器官

肝功能檢查異常和肝損傷在COVID-19患者中的患病率很高。肝臟相關(guān)并發(fā)癥包括總膽紅素升高和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶異常。肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞是肝臟中的兩種主要功能性細(xì)胞，因此含有這些細(xì)胞類型的類器官研究SARS-CoV-2感染具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

在人類多能干細(xì)胞衍生的肝臟類器官（LO）中，在大多數(shù)白蛋白陽(yáng)性肝細(xì)胞中檢測(cè)到ACE2表達(dá)。SARS-CoV-2假病毒和SARS-CoV-2病毒均被證明可感染肝細(xì)胞。

▉ 腦類器官

COVID-19患者會(huì)出現(xiàn)一系列神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重程度從嗅覺(jué)、味覺(jué)喪失到記憶喪失，再到中風(fēng)。

人類多能干細(xì)胞衍生的腦類器官（BO），包括全腦和區(qū)域腦特異性BO，已應(yīng)用于SARS-CoV-2研究。在皮層，海馬，下丘腦和中腦類器官中鑒定出SARS-CoV-2。星形膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)BO中的SARS-CoV-2感染。

▉ 扁桃體類器官

目前關(guān)于類器官主要集中在宿主反應(yīng)和藥物發(fā)現(xiàn)上。

最近，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了人扁桃體類器官（TO）來(lái)評(píng)估對(duì)SARS-CoV-2疫苗的體液免疫反應(yīng)。特化的生發(fā)中心（GCs）中濾泡輔助T細(xì)胞和B細(xì)胞之間的相互作用在抗原特異性體液反應(yīng)的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

通過(guò)重新聚集解離的人扁桃體組織而獲得的TO維持扁桃體細(xì)胞組成，并支持抗原特異性體細(xì)胞超突變，親和力成熟和人B細(xì)胞的分類切換。在使用減毒活流感疫苗進(jìn)行免疫接種后，TOs分化成了具有清晰光區(qū)和暗區(qū)，這一分區(qū)對(duì)于GC選擇至關(guān)重要。B細(xì)胞從暗區(qū)遷移到光區(qū)，與濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞和濾泡輔助T細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)GC反應(yīng)。

▉ 其他類型類器官

COVID-19住院患者出現(xiàn)眼部異常，包括結(jié)膜炎。ACE2和TMPRSS2在hPSC衍生的視網(wǎng)膜類器官（RO）中表達(dá)。SARS-CoV-2假病毒和實(shí)時(shí)SARS-CoV-2可感染人類多能干細(xì)胞衍生的RO。感染后的RO和人眼細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的SARS-CoV-2復(fù)制和宿主免疫應(yīng)答，包括NF-κB信號(hào)通路激活。

最近，利用與內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)的人類多能干細(xì)胞衍生的心臟類器官來(lái)模擬在COVID-19患者心臟中觀察到的細(xì)胞因子風(fēng)暴。人毛細(xì)血管類器官（CAPOs）類似于人毛細(xì)血管的管腔結(jié)構(gòu)以及內(nèi)皮細(xì)胞、包膜和基底膜。

▉ 多能干細(xì)胞類器官和成體類器官

多能干細(xì)胞類器官的和成體類器官在可用性，可編輯性，成熟度和多樣性方面有利有弊。

從理論上講，多能干細(xì)胞具有無(wú)限的增殖能力和發(fā)育潛力，可以在所有三個(gè)胚層中產(chǎn)生類器官。多能干細(xì)胞衍生的類器官可以大規(guī)模研究，如代謝分析和藥物篩選。某些類器官，如腦和心臟類器官，只能從多能干細(xì)胞獲得。

相比之下，成體類器官具有有限的自我更新能力，限制了在可擴(kuò)展研究中的應(yīng)用?；蚓庉嫾夹g(shù)已應(yīng)用于多能干細(xì)胞衍生和成體類器官，以研究基因/變異在SARS-CoV-2感染中的作用。成體類器官的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是成熟度。與成體類器官不同，大多數(shù)多能干細(xì)胞衍生的類器官仍存在胎兒或新生兒身份，需要進(jìn)一步改善成熟狀態(tài)?？傊?，具有不同遺傳背景的類器官可以應(yīng)用于探索遺傳背景對(duì)疾病進(jìn)展的影響。

圖3：hPSC在三個(gè)胚層中定向分化為類器官

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如虎添翼

在過(guò)去的兩年中，類器官在COVID-19建模方面大顯身手，取得了重要進(jìn)展。然而，類器官模型，目前仍存在一定的局限性，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

例如，免疫血管類器官；3D打印和器官芯片技術(shù)結(jié)合開(kāi)發(fā)更加真實(shí)的類器官；應(yīng)用單細(xì)胞技術(shù)深入研究；應(yīng)用基因組測(cè)序和基因編輯來(lái)探索病毒感染期間的基因型-表型相關(guān)性（圖4）。

圖4：類器官模型在傳染病研究中的未來(lái)應(yīng)用

▉ 免疫血管類器官

用于COVID-19研究的大多數(shù)類器官僅包含宿主器官的細(xì)胞，缺乏其它細(xì)胞（如免疫細(xì)胞和血管細(xì)胞）。免疫細(xì)胞是COVID-19疾病進(jìn)展的關(guān)鍵。免疫介導(dǎo)的損傷，在宿主損傷中可能比直接感染更重要。因此，類器官與免疫細(xì)胞的體外共培養(yǎng)，還可用于研究由免疫細(xì)胞引起的COVID-19。此外，具有免疫細(xì)胞的類器官可更好地理解受感染的宿主細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用，免疫調(diào)節(jié)分子如何影響免疫成分，以及免疫反應(yīng)如何影響受感染的宿主組織。

類器官的局限性是缺乏血管。血栓并發(fā)癥在COVID-19中很常見(jiàn)，并發(fā)生死亡。類器官與血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞共培養(yǎng)以形成血管化類器官，為建立新型類器官模型提供了希望。宿主細(xì)胞、免疫細(xì)胞和血管細(xì)胞組成的免疫-血管-類器官模型將推進(jìn)類器官技術(shù)，并為研究新出現(xiàn)病毒的感染提供高階版模型（圖5）。

圖5：血管免疫-肺泡類器官的發(fā)育。

▉ 類器官和3D生物打印

在類器官中包括不同的細(xì)胞很重要，細(xì)胞位置和組織間相互作用對(duì)于類器官也很重要。3D生物打印技術(shù)，使用生物墨水中含有的組織特異性細(xì)胞，并通過(guò)分層打印技術(shù)重建人體器官樣結(jié)構(gòu)。3D生物打印生成的器官模擬系統(tǒng)技術(shù)在人體病毒感染研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

▉ 類器官芯片

器官芯片，一種用于在連續(xù)灌注的小腔室中培養(yǎng)細(xì)胞和組織的微流體裝置。芯片上的器官系統(tǒng)允許創(chuàng)建動(dòng)態(tài)和可控的微環(huán)境，適合研究病毒-宿主相互作用，對(duì)病毒治療的耐藥性的演變，新的抗病毒療法的開(kāi)發(fā)以及潛在的病毒發(fā)病機(jī)制。在芯片上培養(yǎng)的類器官為在器官水平上概括生理功能提供了新的可能性，這將進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)COVID-19發(fā)病機(jī)制的理解。

▉ 類器官和單細(xì)胞多組學(xué)分析

類器官的優(yōu)點(diǎn)是含有多種類型的細(xì)胞，用于探索病毒與不同宿主細(xì)胞之間的相互作用，以及病毒感染時(shí)宿主細(xì)胞之間的相互作用?；趕cRNA-seq分析的總體ACE2表達(dá)較低。例如，肺AT2細(xì)胞中ACE2陽(yáng)性細(xì)胞在0.3%~2.4%之間變化，這反映了scRNA-seq平臺(tái)的檢測(cè)低靈敏度。因此，有必要深入解析SARS-CoV-2進(jìn)入因子表達(dá)的scRNA-seq數(shù)據(jù)。此外，scRNA-seq數(shù)據(jù)需要通過(guò)獨(dú)立方法進(jìn)一步驗(yàn)證，例如免疫染色或流式細(xì)胞術(shù)分析。這些類型的研究有望以單細(xì)胞分辨率深入了解SARS-CoV-2感染時(shí)宿主細(xì)胞反應(yīng)和宿主細(xì)胞相互作用。

▉ 類器官和全基因組關(guān)聯(lián)研究

人類多能干細(xì)胞和成體類器官可來(lái)自不同遺傳背景的個(gè)體，這為探索遺傳變異對(duì)疾病進(jìn)展（包括病毒感染）的影響提供了可靠的模型。一方面，基于CRISPR的基因編輯可有效敲除單個(gè)基因位點(diǎn)，為產(chǎn)生等位基因hPSC/類器官提供高通量平臺(tái)。等位基因hPSC/類器官可用于確定單個(gè)基因/遺傳位點(diǎn)，甚至是單核苷酸多態(tài)性在病毒感染和宿主損傷中的精確作用。另一方面，通過(guò)將全基因組測(cè)序和不同供體的類器官篩選相結(jié)合，進(jìn)行基因型表型研究，以確定與病毒感染相關(guān)的新基因/位點(diǎn)/變異。此外，不同供體類器官也可用于調(diào)查個(gè)體對(duì)抗病毒藥物的反應(yīng)，有助于開(kāi)發(fā)個(gè)性化治療。

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結(jié)束語(yǔ)

類器官研究，為COVID-19疾病建模和藥物篩選做出了重大貢獻(xiàn)。類器官仍然存在一些局限性，與動(dòng)物模型相比，缺乏功能性的血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)是類器官的缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)使類器官遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上體內(nèi)模型。在現(xiàn)階段，疫苗和藥物開(kāi)發(fā)仍然需要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

未來(lái)，類器官將用于模擬更復(fù)雜的器官，模擬器官內(nèi)相互作用，并探索致病機(jī)制。來(lái)自健康或COVID-19患者的類器官，可提供不同年齡、性別或種族群體個(gè)體的病毒易感性的可靠分子評(píng)估，并為當(dāng)前和未來(lái)的大流行提供個(gè)性化的治療策略。

類器官，就類似于調(diào)制一杯雞尾酒，還有很長(zhǎng)的路要走 。

參考文獻(xiàn)：

https:///10.1038/s41592-022-01453-y

《自然 · 綜述》：T細(xì)胞在衰老中的角色

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