圖1 不同基因型小麥根系檸檬酸的分泌情況

我們進(jìn)一步通過(guò)比較來(lái)自OX-OsALMT4和OX-null的根樣品，明確了OsALMT4活性對(duì)根系微生物群的影響。結(jié)果表明，定殖于OX-OsALMT4根尖的細(xì)菌群落與OX-null的顯著不同（P=0.02），在OX-OsALMT4根基定殖的群落也與OX-null的顯著不同（P=0.006）。然而，與OsALMT4活性相關(guān)的變化遠(yuǎn)小于根尖和根基之間的差異。DESeq2分析表明，兩種基因型之間的一些OTUs豐度存在顯著差異（圖3）。OX-OsALMT4根尖和根基的β-變形菌綱的八個(gè)OTUs和放線菌綱的兩個(gè)OTUs（OTU29和OTU45）的豐度高于OX-null的根尖和根基。與OX-OsALMT4相比，八個(gè)芽孢桿菌綱的OTUs在OX-null根基富集（圖3B），其中一個(gè)（OTU78）也在OX-null的根尖富集。這些結(jié)果表明，根尖上的OsALMT4活性顯著影響了水稻根系細(xì)菌群落。

我們將小麥NIL-null種植在Ferrosol土壤中和用石膏改性的Ferrosol土壤中。Ferrosol土壤中高濃度的Al³⁺激活TaALMT1通道，從根尖釋放蘋果酸和其他底物，而改性Ferrosol土壤中較低Al³⁺濃度不會(huì)激活TaALMT1。我們研究了初生根根尖和根基的細(xì)菌和真菌微生物群落特征，并對(duì)兩種土壤進(jìn)行了比較。原假設(shè)是TaALMT1活性不影響初生根的細(xì)菌或真菌微生物群。DCA分析表明，細(xì)菌和真菌群落的差異最大的是土體土和根基，而根尖的群落則介于這兩者之間（圖4）。Ferrosol土改性后，土體土中細(xì)菌和真菌群落也發(fā)生了顯著的變化（P<0.005）。通過(guò)比較從Ferrosol（激活TaALMT1）和石膏改性的Ferrosol（未激活TaALMT1）土壤中采集的根樣品，確定了TaALMT1活性對(duì)根微生物群落的影響。Ferrosol土壤中植物根尖的微生物群落與改性Ferrosol土壤中的明顯不同。類似地，F(xiàn)errosol土壤中植物根基的群落與改性Ferrosol土壤中的也顯著不同（P<0.005；圖4）。

圖4 TaALMT1活性對(duì)小麥根系微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

圖5顯示了生長(zhǎng)在Ferrosol土壤中和改性Ferrosol土壤中的根樣品在豐度上存在顯著差異的OTUs。對(duì)于細(xì)菌而言，生長(zhǎng)在Ferrosol土壤中的根尖顯著富集了六個(gè)屬于Peptoclostridium difficile屬、節(jié)桿菌屬、馬賽菌屬和Alkanindiges屬的OTUs（圖5A）。生長(zhǎng)在改性Ferrosol土壤中的根尖富集了八個(gè)主要屬于放線菌綱和纖線桿菌綱的OTUs。與改性Ferrosol土壤相比（圖5B），在Ferrosol土壤的根基富集的15個(gè)OTUs中，有7個(gè)屬于放線菌門（主要是鏈霉菌屬）和3個(gè)擬桿菌屬。根尖富集了兩個(gè)屬于擬桿菌屬的OTUs（OTU875和OTU2064）。而改性Ferrosol土壤的根基富集了七個(gè)OTUs（圖5B）。對(duì)于真菌而言，生長(zhǎng)在Ferrosol土壤中的根尖富集了17個(gè)OTUs（圖6A）。在兩種土壤中，根基有9個(gè)真菌OTUs在豐度上存在差異，大多數(shù)在改性Ferrosol土壤生長(zhǎng)的植物中得到富集（圖6B）。由于向Ferrosol土壤中添加石膏顯著改變了土體土壤樣品中的細(xì)菌群落，我們需要確定這些變化是否導(dǎo)致了根微生物的差異。我們認(rèn)為根系微生物群落的差異不是由土體土群落的差異引起的，原因有兩點(diǎn)：首先，添加石膏后的土體土群落的差異遠(yuǎn)小于在兩種土壤中生長(zhǎng)的根樣的差異（圖4）；第二，添加石膏后土體土中OTUs的變化并沒(méi)有反映在土壤中生長(zhǎng)的根樣品中。例如，與改性的Ferrosol土壤相比，F(xiàn)errosol土壤的土體土富集了屬于綠彎菌門的11個(gè)OTUs（圖5C），但這些OTUs并沒(méi)有在這些土壤中收集的根樣品中富集（圖5A和B）。此外，在Ferrosol土壤生長(zhǎng)的植物中，根尖富集了六個(gè)屬于梭菌綱的OTUs，根基富集了三個(gè)梭菌綱OTUs，但這兩種土體土的梭菌綱在豐度上沒(méi)有差異（圖5）。在真菌中，生長(zhǎng)在Ferrosol土壤和改性Ferrosol土壤的根尖中的25個(gè)OTUs在豐度上存在顯著的差異（圖6A）。其中只有兩個(gè)（OTU24和OTU75）在土體土之間表現(xiàn)出差異，這再次表明根系主要受TaALMT1活性差異的影響，而與兩種土壤之間差異無(wú)關(guān)（圖6C）。結(jié)果表明，TaALMT1活性顯著改變了小麥根系上的細(xì)菌和真菌微生物群落，這也否定了上述的原假設(shè)。

圖5 TaALMT1活性對(duì)小麥根系細(xì)菌群的影響

圖6 TaALMT1活性對(duì)小麥根系真菌微生物群的影響

在Red Chromosol土壤和Ferrosol土壤中分別培養(yǎng)NIL-null（無(wú)檸檬酸釋放）和NIL-TaMATE1B（從根尖釋放檸檬酸）植株。當(dāng)在Ferrosol土壤中生長(zhǎng)時(shí)，它們都會(huì)通過(guò)TaALMT1從根尖釋放蘋果酸和其他底物，但在Red Chromosol土壤中則不會(huì)。本實(shí)驗(yàn)中的原假設(shè)是：（1）TaMATE1B釋放檸檬酸鹽不會(huì)影響在Red Chromosol土壤中的根微生物，（2）TaALMT1在仍然具有活性釋放的情況下，TaMATE1B釋放檸檬酸鹽不會(huì)進(jìn)一步改變?cè)贔errosol土壤中的根微生物。

結(jié)果表明，盆栽深度（上層、中層和下層）和采樣時(shí)間（8和31天）對(duì)土壤微生物群落沒(méi)有顯著影響。根系對(duì)這些土壤中細(xì)菌群落的影響比對(duì)真菌群落的影響更大。DCA和mvabund分析表明，在兩種試驗(yàn)土壤中，初生根根尖、初生根根基、分枝根根尖和分枝根根基上的細(xì)菌和真菌（Figure S6, C and D）群落彼此顯著不同（mvabund P<0.005）。我們通過(guò)比較生長(zhǎng)在Red Chromosol土壤中的NIL-null和NIL-TaMATE1B根系上的群落，評(píng)估了檸檬酸鹽釋放對(duì)根系微生物群的影響。我們比較了兩種基因型的每種根組織類型上的微生物群落結(jié)構(gòu)。對(duì)于細(xì)菌而言，在初生根根尖、初生根根基和分枝根根基檢測(cè)到基因型之間的顯著差異。對(duì)于真菌群落而言，顯著差異僅出現(xiàn)在初生根根基上（表2）。在Red Chromosol土壤中，許多細(xì)菌OTUs對(duì)一種基因型表現(xiàn)出明顯的偏好。例如，NIL-TaMATE1B的初生根根尖富集了八個(gè)梭菌綱的OTUs（圖7A），NIL-TaMATE1B的分枝根根尖富集了11個(gè)β-變形菌綱的OTUs（圖7B），NIL-null的初生根基部富集了6個(gè)放線菌綱的OTUs（圖7C）。NIL-null的兩種根型的根基上富集了兩個(gè)桿菌綱的OTUs（OTU8和OTU74）；有趣的是，NIL-TaMATE1B的初生根和分枝根根尖富集了一個(gè)變形菌綱的OTU（OTU1），但其卻在NIL-null的根基富集（圖7）。幾個(gè)真菌OTUs的豐度也在NIL-null和NIL-TaMATE1B之間存在差異，其中OTU141在NIL-null的初生根和分枝根基上的豐度顯著更高（圖8C和D）。

最后，我們明確了當(dāng)TaALMT1也具有活性時(shí)，通過(guò)TaMATE1B釋放檸檬酸鹽是否會(huì)改變根微生物。細(xì)菌群落的兩兩比較顯示，NIL-null和NIL-TaMATE1B在初生根根基和分枝根根尖存在顯著差異。而真菌僅在分枝根根基檢測(cè)到顯著差異（表2）。

然而，在Ferrosol土壤中，NIL-TaMATE1B根上（釋放蘋果酸和檸檬酸）與NIL-null根上（僅釋放蘋果酸）豐度存在差異的細(xì)菌較少。NIL-TaMATE1B的初生根和分枝根的根尖上富集了屬于放線菌綱的OTU6，初生根根尖富集了四個(gè)梭菌綱的OTUs（OTU1018、577、875和2064）（圖7A和B）。在NIL-TaMATE1B的分枝根根尖富集了三個(gè)β-變形菌綱的OTUs（OTU26、723和260）（圖7B）。僅在Ferrosol土壤中檢測(cè)到NIL-null初生根根基部的四個(gè)梭菌綱、兩個(gè)α-變形菌綱、一個(gè)嗜熱菌和一個(gè)氯屈曲菌JG37-AG-4豐度的變化（圖7C），NIL-null的分枝根基部富集了OTU487（圖7D）。在Ferrosol土壤培養(yǎng)的NIL-TaMATE1B的初生根根尖富集了孢霉綱（OTU289）和Rozellomycota（OTU6）（圖8A），NIL-null的分枝根根尖富集了散囊菌綱（OTU62）和Leotomycetes綱（OTU117）（圖8B），NIL-TaMATE1B的分枝根根基部富集了三個(gè)Orbilomycetes綱的OTUs（圖8D）。

圖7 TaMATE1B對(duì)具有和不具有TaALMT1活性的小麥根系細(xì)菌微生物群的影響

圖8 TaMATE1B對(duì)具有和不具有TaALMT1活性的小麥根系真菌微生物群的影響

表2 TaMATE1B活性對(duì)具有和不具有TaALMT1活性的小麥根系微生物群的影響