  關(guān)于寄生蟲的科學(xué)鑒定（2） 上次寫到了提取DNA，今天接著寫后續(xù)步驟。 當(dāng)把DNA提取之后即可以作為模板，接下來(lái)就是跑PCR，也就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以加進(jìn)去的引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA過(guò)程。 PCR技術(shù)可運(yùn)用到基因分離克隆和表達(dá)調(diào)控、多態(tài)性研究、序列分析中。 PCR的反應(yīng)過(guò)程具體如下。 先是變性，通過(guò)加熱到94攝氏度，持續(xù)30秒，使DNA雙鏈間的氫鏈斷裂，分開(kāi)形成單鏈。 然后就是退火，即溫度降低，在溫度55攝氏度的情況下，引物與模板DNA中的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，形成雜交分子。 這個(gè)雜交分子在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+存在的情況下，DNA聚合酶催化引物按5’端向3’端方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈。 在延伸反應(yīng)中要求溫度在70-72攝氏度，反應(yīng)時(shí)間為30-60秒。這里的加溫?cái)嗔眩缓蠼禍亟Y(jié)合，然后又升溫延伸為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，目的DNA就是以2n的形式增加。 buffer是由純水和氯鉀、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的PH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中發(fā)揮活性；氯化鉀可以降低退火溫度，但濃度不能超過(guò)50mmol/升。 鎂濃度為1.5-2mol/升，其對(duì)應(yīng)核苷酸為200微升，核苷酸與鎂離子有一個(gè)對(duì)應(yīng)濃度關(guān)系，核苷酸與Taq酶競(jìng)爭(zhēng)鎂離子，當(dāng)核苷酸濃度達(dá)到1mmol/升，就會(huì)抑制Taq酶活性，而鎂離子能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。 2個(gè)primer各0.2微升，4種核苷酸（A、T、C、G）。 牛血清白蛋白（BSA）100微升，用于提高蛋白質(zhì)的濃度，在反應(yīng)中對(duì)酶起保護(hù)作用，防止酶的分解和非特意性吸附，減輕有些酶的變性，減輕加熱、化學(xué)因素和表面張力中酶的變性，有的人也會(huì)對(duì)這個(gè)白蛋白過(guò)敏。 每個(gè)反應(yīng)體系Taq酶1-2.5個(gè)單位，這個(gè)酶分成兩種，一種是R型，一種是L型。能耐受94-95攝氏度的溫度，參與DNA聚合酶的反應(yīng)中，L型的保真性更好，耐肥溫度也更高。 模板DNA，大約有10的2至5次方個(gè)分子。最后加上又雙蒸水，補(bǔ)至到所需體積。  |
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