基因療法不僅可以治療多種遺傳病，還可以治療非遺傳性疾病。目前基因治療使用最多的是人工改造后的病毒（如常用的AAV載體）作為治療性基因的載體，將治療性基因或小的核酸片段遞送到患者體內(nèi)相應器官或組織細胞內(nèi)，如圖1所示。作為最先進的疾病療法，已有多種基因療法獲批上市，其中包括數(shù)種遺傳病基因療法和癌癥基因療法等。隨著成百上千種基因治療臨床項目的快速推進，未來幾年會有越來越多的基因療法被推向市場。為了跟上臨床研究的快速發(fā)展，研發(fā)人員正在努力簡化及標準化基因治療產(chǎn)品的制造及質(zhì)量控制（QC）流程，以提高基因治療產(chǎn)品質(zhì)量并降低基因治療藥物制造成本。

研發(fā)人員使用多種分析手段來檢測基因治療產(chǎn)品及優(yōu)化其制造流程，遇到異常結果時，需要研發(fā)人員給出合理的解釋：生產(chǎn)過程中產(chǎn)生了不良制品？還是檢測方法不可靠？亦或其他原因。具有專業(yè)檢測人員及相關經(jīng)驗的檢測分析機構經(jīng)常會同基因治療研發(fā)單位的研發(fā)人員合作加強檢測方法及其分析的可靠性或合規(guī)性。

1. 衣殼空載

研發(fā)人員面臨的主要挑戰(zhàn)源自AAV載體本身（如圖2所示），例如空的AAV衣殼，基因治療產(chǎn)品純化過程中必須將其最小化，因為這些病毒衣殼不包含DNA，當將它們輸注給患者時，它們沒有任何治療益處，還有可能引起致命的副反應，例如免疫毒性。對于包含治療基因部分拷貝的衣殼也是如此，這可能是由于在生產(chǎn)過程中病毒包裝不完全引起的。

此外，空衣殼或包裝不完全的衣殼可與完整衣殼競爭以感染患者的細胞。給藥劑量中非活性病毒的衣殼的量越大，患者為達到治療效果所需的藥物總劑量就越高。給藥劑量越高，發(fā)生嚴重副反應的風險越高。

這些雜質(zhì)是如何產(chǎn)生的？由于AAV衣殼由60個衣殼蛋白組裝而成，具有確定的形狀結構。但組成AAV衣殼構建模塊的三種蛋白在細胞內(nèi)的比例可能會因影響而致波動較大，而且特定的衣殼蛋白的翻譯后修飾可能會有所差異。這些復雜性促進了形成缺陷病毒的概率。在微觀層面即分子水平上，這些雜質(zhì)與理想的活性AAV非常相似，給工藝下游的純化去除造成了一定的難度。因此，最好在上游的病毒包裝制備工程中盡量降低無活性病毒的比例，一方面提高了病毒的產(chǎn)量或質(zhì)量，一方面降低下游純化的壓力。

目前有多種方法可以測量空殼/全病毒比例（the empty/full capsid ratio），當開發(fā)人員建立CMC時（CMC全稱為Chemical Manufacturing and Control，包括生產(chǎn)工藝、雜質(zhì)研究、質(zhì)量研究及穩(wěn)定性研究等，即藥學研究部分。藥學研究資料，是藥品申報資料中非常重要的部分。），選擇一種優(yōu)化方法非常重要，因為他們必須使用該方法進行有效的質(zhì)量控制，以判斷產(chǎn)品是否符合放行標準及評估不同批次產(chǎn)品間的穩(wěn)定。

其中一種方法是通過透射電鏡（TEM）來確定空殼/全病毒比例。這種方法較為經(jīng)典，但偶爾由于染色過程的差異，可能導致一定誤判。有研發(fā)人員是用酶聯(lián)免疫吸附法測定病毒總顆粒，用QPC R法測定病毒總基因組，因此可以計算出空殼/全病毒比例，但由于QPCR滴度可能有很大的變化，因此空殼/全病毒比例通常不是很可靠。還有一種方法采用分析超速離心法，在不同密度下分離出空殼和全病毒，并根據(jù)總蛋白含量計算其比例。此外，最近，報道有研究人員采用SEC法（size-exclusion chromatography）或Qubit 熒光定量（Qubit Fluorometric Quantification kit）方法定量AAV空殼/全病毒比例，這兩種方法樣本用量較分析超速離心法少很多，且可以高通量操作，據(jù)報道SEC法與Qubit 熒光定量檢測精確度相近，但Qubit 熒光定量顯然在試劑等成本考慮方面更具優(yōu)勢，且無需大型設備儀器。

2. 衣殼分子指紋

病毒衣殼蛋白需要由正確的蛋白序列制成，并且它們通常需要加上特定的翻譯后基團才能在細胞中充分發(fā)揮活性。這方面質(zhì)量控制，可通過肽圖分析方法進行檢測。通過液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS / MS）可完成相關肽圖分析，它可繪制出AAV顆粒在細胞中發(fā)揮正常功能所需的主要蛋白質(zhì)序列和翻譯后修飾。

除了可用于自身蛋白序列質(zhì)量檢測外，還可以用以檢測衣殼產(chǎn)量、雜質(zhì)含量等，這些數(shù)據(jù)可以與生產(chǎn)工藝參數(shù)的改變聯(lián)系起來以優(yōu)化生產(chǎn)工藝。

3. 病毒活性與制品雜質(zhì)

必須對基因治療病毒載體轉(zhuǎn)導細胞的能力或活性進行檢測，此外還得測試制品雜質(zhì)對細胞是否具有毒性。

通過載體轉(zhuǎn)導細胞后，表達產(chǎn)物引起的細胞表型或功能變化來評估產(chǎn)品的活性或效能。開發(fā)這些檢測方法得“具體問題具體分析”，因為沒有一種“放之四海而皆準”的檢測方法供開發(fā)人員使用，例如有的可以通過定量表達產(chǎn)物的活性來測試轉(zhuǎn)導效率或病毒活性，不同的基因的產(chǎn)物活性檢測方法不同；有的產(chǎn)品因檢測其產(chǎn)物活性存在困難而只能通過檢測產(chǎn)物物理含量來測試其轉(zhuǎn)導效率或產(chǎn)物表達量，例如通過westernblot、流式細胞術、ELISA等。

此外，基因治療產(chǎn)品需經(jīng)過檢測確保其雜質(zhì)殘留量低至規(guī)定標準，以確保安全?；蛑委熤破冯s質(zhì)主要包括工藝相關雜質(zhì)、制品相關雜質(zhì)以及外源污染物。應盡可能地對雜質(zhì)進行分析鑒定，并采用適宜的方法評估其對生物學活性和安全性的影響。

4. 產(chǎn)品成本

由于基因治療是一個新興領域，因此對于提高基因治療CMC效率的指導方針還未得到足夠的完善，行業(yè)內(nèi)相關的研發(fā)人員急需更加完善的指導性文件，這需要包括研發(fā)人員在內(nèi)的相關人員的共同努力。目前人們正在努力標準化過程，以便更好地比較載體的質(zhì)量，希望最終建立通用的劑量單位。目前急需要開發(fā)出更強大的分析測定方法，以確保基因療法開發(fā)和隨后輸注給患者時質(zhì)量控制的一致性。

此外，由于該技術的新穎性，用于分析評估基因療法質(zhì)量的行業(yè)標準也在不斷變化。直到2020年1月，F(xiàn)DA才為相關研發(fā)人員發(fā)布了七項新指南，值得注意的是，早期的基因療法參與者視此指南為最低要求，目前他們在開發(fā)基因療法時正在努力使產(chǎn)品達到更高的質(zhì)量標準，并樂于分享關鍵發(fā)現(xiàn)以制定未來的行業(yè)標準。監(jiān)管機構對審查基因療法越來越熟悉，其商業(yè)化之路將走得更快。不可否認，基因療法將為患者帶來不可思議的收益，但是對于提高生產(chǎn)效率和降低成本，使基因療法更容易且更廣的惠及患者，至關重要。