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來(lái)源：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)
大家都知道，目前檢測(cè)病毒RNA最為有效的方法是RT-qPCR，該方法也是目前檢測(cè)病毒RNA的金標(biāo)準(zhǔn)。
但是因?yàn)榉椒ū旧淼木窒扌裕鋵?duì)人員、場(chǎng)地、耗時(shí)等因素的較高要求，導(dǎo)致在現(xiàn)如今防疫重壓下，采樣檢測(cè)人員開(kāi)足馬力輪軸轉(zhuǎn)，仍有民眾不滿檢疫效率的尷尬境地。有沒(méi)有更加準(zhǔn)確高效的病毒檢測(cè)方法呢？我們知道，在已有的檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)新的病毒檢測(cè)技術(shù)，核心就是減少檢測(cè)時(shí)間和增加檢測(cè)通量。事實(shí)上，學(xué)界關(guān)于開(kāi)發(fā)新的病毒檢測(cè)技術(shù)的努力從來(lái)沒(méi)有停止過(guò)。今天檢驗(yàn)君為大家介紹幾種新的病毒檢測(cè)技術(shù)，或許未來(lái)的某一天，這些新技術(shù)能為疫情防控帶來(lái)新的曙光。中國(guó)科學(xué)家研發(fā)的吹氣測(cè)新冠技術(shù)北京大學(xué)環(huán)境學(xué)院要茂盛教授團(tuán)隊(duì)與北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防與控制中心等團(tuán)隊(duì)合作，集成呼出氣采樣、氣相色譜-離子遷移譜檢測(cè)和機(jī)器學(xué)習(xí)模型，研發(fā)出了新冠感染的無(wú)創(chuàng)呼出氣揮發(fā)性有機(jī)物組合指紋篩查系統(tǒng)，該系統(tǒng)已經(jīng)申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利。該研究已發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)刊物《呼吸研究雜志》。該研究表明，新冠患者和其他呼吸系統(tǒng)疾病患者呼出氣中丙醇水平相比健康受試者顯著升高，而新冠患者呼出氣中丙酮水平相比其他呼吸系統(tǒng)感染患者和健康受試者顯著降低。研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合不同對(duì)照組的呼出氣樣品及其背景環(huán)境空氣進(jìn)行分析，識(shí)別出了12種關(guān)鍵內(nèi)源性VOCs（揮發(fā)性有機(jī)物）標(biāo)志物。這些標(biāo)志物就是篩查識(shí)別新冠感染者獨(dú)一無(wú)二的“指紋”，使其區(qū)別于健康人以及其他呼吸系統(tǒng)疾病的患者。實(shí)際檢測(cè)中，被試者使用一次性呼吸袋，只要呼氣30秒便可完成樣品采集。獲得呼出氣樣本后，系統(tǒng)結(jié)合支持向量、梯度加速和隨機(jī)森林三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)12種關(guān)鍵VOCs標(biāo)志物進(jìn)行建模，最快能在5-10分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)新冠患者快速篩查，而且無(wú)需任何檢測(cè)試劑?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)模型，基于此前參與研究的包括74例新冠患者，30例非新冠呼吸系統(tǒng)感染患者，以及87位醫(yī)務(wù)工作人員和健康受試者，檢測(cè)的特異性和靈敏度達(dá)到了95%以上。目前，新冠感染的無(wú)創(chuàng)呼出氣篩查系統(tǒng)正計(jì)劃擴(kuò)大樣本量，開(kāi)展進(jìn)一步優(yōu)化與測(cè)試，以實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（ITA）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于恒溫?cái)U(kuò)增的新型核酸擴(kuò)增技術(shù),主要包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)、交叉引物擴(kuò)增（CPA）、鏈替代擴(kuò)增（SDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA)等等。雖然不同等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)均采用恒溫?cái)U(kuò)增，但引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增原理差異較大。最常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）。這是一個(gè)相對(duì)成熟的技術(shù)，已經(jīng)出現(xiàn)有不少實(shí)際應(yīng)用的新冠病毒核酸檢測(cè)產(chǎn)品。2020年2月24日，沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所所長(zhǎng)尹秀山博士團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于RT-LAMP技術(shù)的新冠病毒檢測(cè)方法iLACO，可在15~40分鐘內(nèi)快速檢測(cè)新冠病毒。當(dāng)新冠病毒RNA與反應(yīng)混合物中的pH指示劑耦合時(shí)，可以通過(guò)觀察顏色的變化獲得檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性反應(yīng)可導(dǎo)致反應(yīng)混合物的pH降低，pH指示劑從粉紅色變?yōu)辄S色，陰性反應(yīng)仍保持粉紅色。該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性、簡(jiǎn)便性和多功能性表明，即使在沒(méi)有專門的分子生物學(xué)設(shè)備的情況下，iLACO也可以方便地用于新冠病毒的檢測(cè)控制，但仍需臨床驗(yàn)證。RTF-EXPAR，比LAMP更簡(jiǎn)單快速的擴(kuò)增方法 來(lái)自英國(guó)伯明翰大學(xué)的研究人員將經(jīng)典的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（EXPAR）與無(wú)逆轉(zhuǎn)錄（RTF）結(jié)合在一起，發(fā)明了一種全新的核酸擴(kuò)增技術(shù)（RTF-EXPAR），該技術(shù)可以在10分鐘內(nèi)準(zhǔn)確檢測(cè)到低濃度SARS-Cov-2病毒RNA（7.25 copies/uL）。RTF-EXPAR能快速檢測(cè)病毒RNA的關(guān)鍵有兩部分。第一，擴(kuò)增反應(yīng)是一個(gè)等溫過(guò)程，這樣就避免了耗時(shí)的加熱和冷卻步驟；第二，擴(kuò)增的鏈相比PCR和LAMP更小。這兩個(gè)關(guān)鍵因素使得EXPAR反應(yīng)一旦被觸發(fā)，就能在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量的DNA產(chǎn)物有效地放大檢測(cè)信號(hào)。
RTF-EXPAR是一個(gè)分兩步進(jìn)行的方法，需要首先從RNA中利用酶解產(chǎn)生DNA片段，之后再擴(kuò)增DNA片段放大病毒RNA的檢測(cè)信號(hào)。研究人員為了進(jìn)一步提高反應(yīng)時(shí)間，將兩步反應(yīng)合二為一，在同一個(gè)反應(yīng)體系里完成了兩步反應(yīng)，在“一步法”的條件下，相同陽(yáng)性樣品的檢測(cè)時(shí)間從“兩步法”的平均10.33分鐘減少到了平均4分鐘。為了進(jìn)一步比較三種方法的靈敏性，研究人員采用了三種方法進(jìn)行比較研究，確認(rèn)了RTF-EXPAR方法與目前在醫(yī)院使用的PCR和LAMP檢測(cè)方法一樣靈敏，但速度更快。SARS-CoV-2 RNA三種方法檢測(cè)結(jié)果（A. RTF-EXPAR, B. RT-LAMP, C. RT-qPCR）2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主、美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校教授Jennifer Doudna領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用CRISPR基因編輯技術(shù)，提出了一種只需5分鐘就能檢測(cè)出新冠病毒的方法。CRISPR檢測(cè)的工作原理是確定一個(gè)約有20個(gè)堿基的，新冠病毒特有的RNA序列。人工構(gòu)造一個(gè)與目標(biāo)RNA序列互補(bǔ)的“向?qū)А盧NA，在溶液中與目標(biāo)RNA序列結(jié)合。當(dāng)“向?qū)А盧NA與目標(biāo)RNA結(jié)合時(shí)，CRISPR工具的Cas13“剪刀”酶就會(huì)啟動(dòng)，并切斷附近的單鏈RNA。而且，剪切會(huì)釋放單獨(dú)的熒光粒子進(jìn)入測(cè)試溶液中，當(dāng)用激光照射樣本時(shí)，釋放出的熒光粒子就會(huì)發(fā)光，表明病毒存在。起初的CRISPR檢測(cè)方法同樣需要先擴(kuò)增病毒RNA，再進(jìn)行檢測(cè)診斷以保證檢測(cè)的靈敏度。該團(tuán)隊(duì)隨后找到多個(gè)可協(xié)同工作以提高檢測(cè)靈敏度的“向?qū)А盧NA。研究人員報(bào)告稱，使用單一的“向?qū)А盧NA，檢測(cè)限可以達(dá)到100 copies/mL。如果他們添加第二種“向?qū)А盧NA，每微升能檢測(cè)100個(gè)病毒。另外，這種檢測(cè)方法還有另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：相比與定性或半定量的PCR方法，該檢測(cè)方法檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度與樣本中的病毒數(shù)量成正比。這不僅揭示了樣本是否呈陽(yáng)性，還揭示了患者攜帶了多少病毒。
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