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叢枝菌根真菌(AMF)孢子、菌絲密度及侵染率定量測定方法

Practical Methods For arbuscular mycorrhizal fungal spore density, hyphaldensity and colonization rate of AMF

王思雨，魏涵，陳科宇，董強，紀寶明，張靜^*

草業(yè)與草原學院，北京林業(yè)大學，北京

*通訊作者郵箱：zhangjing_2019@bjfu.edu.cn

摘要：叢枝菌根真菌 (Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF) 在陸生菌根中起源最早且分布最廣，可以與大多數(shù)植物根系形成互惠共生體，被譽為"植物根內共生體之母"，對陸地植物的生理、生態(tài)功能具有重要意義，是土壤微生物生態(tài)學研究的熱點對象。而侵染率、菌絲密度、孢子密度是判斷AMF生長發(fā)育狀況的重要指標，常被用于評價AMF與宿主植物的共生狀態(tài)及其生理生態(tài)功能。本方法系對已有方法進行梳理歸納并結合實驗經(jīng)驗改進完善后所得。其中侵染率采用臺盼藍染色法，菌絲密度采用真空泵微孔濾膜抽濾法，孢子密度采用濕篩傾析-蔗糖密度梯度離心法。該方法操作簡便，易于掌握，普遍適用于AMF生長狀況的觀察與測定，同時能夠對目前廣泛應用的AMF群落高通量測序數(shù)據(jù)提供有效的補充，提升對測序結果的解釋度。

關鍵詞：叢枝菌根真菌，侵染率，菌絲密度，孢子密度

研究背景

叢枝菌根是球囊菌門真菌與植物根系組成的共生體系，是一類重要的內生菌根類型(Brundrett and Tedersoo, 2018)。叢枝菌根真菌(AMF)能夠與陸地生態(tài)系統(tǒng)中大多數(shù)植物形成共生關系，幫助植物吸收N、P等礦質元素，提高植物生產(chǎn)力與抗逆性，此外還具有促進土壤水穩(wěn)性團聚體的形成，改善土壤環(huán)境等生態(tài)學意義(Smith and Read, 2008)。AMF侵染植物后會在植物根皮層組織內形成典型的無隔膜的叢枝(arbuscule)、根內菌絲(intraradicalhyphae)和泡囊(vesicle)結構，根外結構則包括土壤中的孢子(spore)和根外菌絲(extraradical hyphae) (Smith and Read, 2008)。其中，叢枝是AMF侵入植物根系皮層細胞后連續(xù)雙叉分枝形成的類似樹枝狀的菌絲結構，是真菌與植物進行物質交換的重要場所，叢枝的卷曲結構增加了其物質交換的表面積，因此叢枝的侵染率常被用于評價AMF-宿主植物的共生狀態(tài)。泡囊是根內菌絲末端膨大而成，富含脂類物質和碳水化合物等，約有80%的AMF可形成泡囊結構，其被認為是養(yǎng)分儲存結構和繁殖器官。根內菌絲則負責傳輸營養(yǎng)物質，與植物和真菌的營養(yǎng)交換有關(Johnson et al., 2003)。根外菌絲在土壤中形成龐大的菌絲網(wǎng)絡，主要是用于擴展AMF在土壤中的侵染空間以及吸收土壤中的礦質營養(yǎng)和水分(Miller,1995)，此外，還參與土壤團聚體的構成，可提高團聚體的穩(wěn)定性，改善土壤狀況(Rillig, 2004)。孢子是AMF發(fā)育到一定階段在根外菌絲上形成的厚壁無性繁殖器官，也是一些脂類的儲藏結構(Smith and Read, 2008)。傳統(tǒng)的AMF鑒定方法主要以孢子的形態(tài)特征為依據(jù)，許多科研工作者在這方面開展了大量研究并對AMF不同種屬的孢子特征作了詳細的描述，以網(wǎng)站的形式提供給研究人員參考 (http://invam./)(Stürmer etal., 2021)，極大地方便了AMF的鑒定。然而孢子的產(chǎn)生受環(huán)境與宿主的影響，因此土壤中孢子的群落與植物根系中 AMF定殖情況有所差異，孢子計數(shù)往往不能真實反映植物根內AMF的群落結構和豐度的變化(Clapp et al., 1995)。隨著分子生物技術手段的不斷發(fā)展，高通量測序技術被廣泛用于檢測土壤或宿主根內的群落結構和多樣性，但只能得到分子種，無法獲得AMF菌株資源(劉永俊和馮虎元, 2010) ，且無法對其進行定量分析。而對AMF侵染效果(侵染率)和生物量(孢子密度、菌絲密度)的測定，不僅是菌根學研究中一項重要的基礎性工作，同時也能夠在一定程度上解決對AMF的定量問題。

本實驗中，AMF侵染率測定基于染色鏡檢法，主要分為根系透明-染色-分色3個過程。關于染色方法目前國內外比較常用的有臺盼藍染色法和酸性品紅染色法，而關于侵染率的統(tǒng)計方法主要有十字交叉法、根段侵染率加權法等。由于研究者所采用的方法不同，其結果也會存在差異。關于侵染率不同測定方法的比較可參考盛萍萍等(2011)人的文章。本文重點介紹采用臺盼藍染色和十字交叉法計算AMF侵染率。關于土壤中菌絲密度的測定同樣也是基于臺盼藍染色和網(wǎng)格交叉法的原理，土壤中孢子的分離則是基于蔗糖密度梯度離心法的原理，采用濕篩傾析-蔗糖梯度離心法進行測定(Brundrett etal., 1994)。

材料與試劑

1.       組織包埋盒

2.       載玻片

3.       蓋玻片

4.       移液槍頭 (5 ml)

5.       0.45 μm微孔濾膜

6.       100 ml離心管

7.       培養(yǎng)皿

8.       根際風干土壤

9.       新鮮根系

10.   10%KOH溶液

11.   蒸餾水

12.   自來水

13.   2%HCl溶液

14.   0.05%臺盼藍 (乳酸:甘油:蒸餾水 = 1:1:1)

15.   脫色液 (甘油:乳酸:蒸餾水 = 1:1:1)

16.   45%-50%蔗糖溶液

儀器設備

1.       剪刀

2.       千分之一天平

3.       500 ml燒杯

4.       水浴鍋

5.       鑷子

6.       計數(shù)器

7.       光學顯微鏡

8.       高速粉碎機

9.       磁力攪拌機

10.   20目篩

11.   400目篩

12.   移液槍 (5 ml)

13.   過濾器

14.   真空抽濾泵

15.   玻璃棒

16.   離心機（有效半徑2.5 cm）

17.   體視鏡

實驗步驟

圖1. 叢枝菌根真菌 (AMF) 孢子、菌絲密度和侵染率測定實驗流程

• 孢子密度測定 (Spore Density)

• 稱取10-20 g風干土樣放入燒杯內，用100 ml自來水浸泡20-30 min。

• 待大的石礫或者雜物沉積在燒杯底部，將上懸液迅速倒在上下分別為20目和400目的雙層篩中。

• 用洗瓶將下層篩中的過濾物沖洗至100 ml離心管中，3000 rpm離心3 min。

• 除去水面雜物及上清液。有時上清液中含有較輕的孢子，應先檢查后再除去。

• 向沉淀物中加入45%-50%的蔗糖溶液至離心管的2/3。

• 攪拌均勻后迅速放入離心機，3000 rpm離心2 min。

• 將上懸液迅速過400目篩，并用自來水沖洗數(shù)分鐘以除去殘留的蔗糖溶液。

• 用洗瓶依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩余物，將其輕輕沖洗到一個清潔的培養(yǎng)皿中。

• 轉移至培養(yǎng)皿后，于體視鏡下進行觀察統(tǒng)計培養(yǎng)皿內所有孢子數(shù)量。

二.   菌絲密度測定 (Hyphal Density)

1.       稱取5 g過1 mm篩的風干土樣至高速粉碎機中，加入50 ml自來水，充分攪拌30 s (10,000 rpm)。

2.       將上清液倒入上下分別為20目和400目的雙層篩中，并用200 ml自來水將400目上的篩余物轉移到500 ml燒懷中。

3.       將燒杯放置于磁力攪拌器進行攪拌，1000 rpm離心30 s。

4.       靜置30 s。

5.       利用移液槍在液面下1 cm處吸取5 ml，通過真空抽濾泵過0.45 μm孔徑的微孔濾膜。

6.       將過濾后的濾膜置于載玻片。

7.       重復3至6步，每個樣品制備3個濾膜。

8.       在濾膜上滴加3滴0.05%的臺盼藍。

9.       待風干后加1滴乳酸甘油，蓋上蓋玻片。

10.   在200×帶網(wǎng)格測微網(wǎng)的顯微鏡下觀察25個視野。

11.   使用網(wǎng)格交叉法計數(shù)交叉點，計數(shù)方法如圖2。其中AMF菌絲與非AMF菌絲主要通過菌絲的形態(tài)及著色進行區(qū)分，AMF菌絲無隔、多分枝且被臺盼藍染成藍色。

圖2. 叢枝菌根真菌 (AMF)菌絲密度網(wǎng)格交叉法

12.   將菌絲長度換算為菌絲密度 (m g^-1 soil)。

菌絲密度公式(Brundrett, 1994)：

注釋：

11/14是網(wǎng)格計算方法中的一個常數(shù)，25為視野個數(shù)。

稀釋倍數(shù)：每次從200ml轉移液中吸取5ml過濾膜，因此稀釋倍數(shù)為40倍。

網(wǎng)格單元格長度：一般實驗室顯微鏡最小單元格的邊長設置為1mm

網(wǎng)格面積：正方形網(wǎng)格邊長為1cm，面積為1cm²

濾膜面積：油水混合膜（膜的規(guī)格可咨詢經(jīng)銷商）

三.    侵染率測定 (Colonization of AMF)

1.       稱取1-2 g左右的新鮮根系，清洗后剪成約1 cm的根段，放入組織包埋盒內。

2.       將組織包埋盒放入裝有10% KOH溶液的500 ml燒杯中浸沒，90 °C水浴鍋內放置10 -90 min(不同根系樣品水浴時間不同，目的是去除根系細胞內含物和細胞壁色素，使得根系透明)。

3.       棄去KOH溶液，用鑷子夾住組織包埋盒，蒸餾水沖洗干凈。

4.       將組織包埋盒浸泡在裝有2% HCl溶液的燒杯內，常溫5-10 min。

5.       棄去HCl溶液，用鑷子夾住組織包埋盒，蒸餾水沖洗干凈。

6.       將組織包埋盒浸泡在裝有0.05%臺盼藍溶液的燒杯內，90 °C水浴鍋內染色10-30 min。

7.       棄去染液，用鑷子夾住組織包埋盒，蒸餾水沖洗干凈。

8.       將組織包埋盒浸泡在裝有脫色液的燒杯內，常溫脫色2-3 d。

9.       脫色后隨機挑取30-50個根段制片，每張載玻片壓制10根。

10.   在200×顯微鏡下采用如圖3所示的十字交叉法進行侵染率測定(McGonigle et al., 1990)，顯微鏡十字線中的一條與根系平行，觀察另一條與菌絲、叢枝、泡囊是否存在交叉點，每個根段觀察10個視野，共計100個視野。

圖3.AMF侵染率十字交叉法(仿McGonigleet al., 1990)

11.   采用0-1計數(shù)，將有菌絲、叢枝和囊泡交叉的分別記為1，沒有則記為0，統(tǒng)計結果記錄在表1。之后根據(jù)如下公式進行計算：

注：菌絲與叢枝侵染率的計算方法與泡囊相同

例如表1中，樣品1的泡囊侵染率 = (38355) = 10.70%          

            叢枝侵染率 = (23355) = 6.48%

菌絲侵染率 =(134355) = 37.75%

            總侵染率=  = 54.93%

表1 叢枝菌根真菌 (AMF)侵染率統(tǒng)計

溶液配方

1.       10%KOH溶液

天平稱取10 g KOH，向燒杯內加入90 g (90 ml) 蒸餾水并用玻璃棒攪拌至完全溶解。

2.       0.05%臺盼藍 (乳酸:甘油:蒸餾水 = 1:1:1)

天平稱取0.15 g臺盼藍，放入燒杯后加入100 ml蒸餾水、100 ml乳酸、100ml甘油，并用玻璃棒攪拌至完全溶解。配制完成后置于4 °C冰箱中保存?zhèn)溆?span style="color:black;">。

1. 3.     脫色液

在燒杯中加入100ml蒸餾水、100ml乳酸、100ml甘油，并用玻璃棒攪拌至完全溶解。配制完成后置于4 °C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

4.       45%-50%蔗糖溶液

天平稱取45-50 g蔗糖，放入燒杯后加入50-55 g (50-55 ml) 自來水并用玻璃棒攪拌至完全溶解。

致謝

感謝北京林業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃(X202110022240)及北京林業(yè)大學中央高校基本科研業(yè)務費專項資金項目(BLX201937)對本研究的大力支持，感謝中國農業(yè)大學張林副教授對實驗流程提供的指導。

附圖1

附圖1.叢枝菌根真菌（AMF）顯微鏡觀察照片a.顯微鏡下的AMF孢子；b.土壤中AMF菌絲結構；c.根系中AMF侵染結構。

參考文獻

1. 劉永俊, 馮虎元. (2010).叢枝菌根真菌系統(tǒng)分類及群落研究技術進展. 應用生態(tài)學報, 216:1573-1580.

2. 盛萍萍, 劉潤進, 李敏. (2011). 叢枝菌根觀察與侵染率測定方法的比較. 菌物學報, 30(4): 519-525.

3. Smith, S. E.and Read, D. J. (2008). Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, Cambridge, UK.

4. Brundrett,M.C. and Tedersoo, L. (2018). Evolutionary history of mycorrhizal symbioses and global hostplant diversity. New Phytol 220:1108-1115.

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7. Rillig, M. C.(2004). Arbuscular mycorrhizae and terrestrial ecosystem processes. EcolLett  7: 740-754.

8. Stürmer, S.L., Bever, J. D., Schultz, P. A. and Bentivenga, S. P. (2021). Celebrating INVAM: 35 years of the largest living culturecollection of arbuscular mycorrhizal fungi. Mycorrhiza31:117-126

9. McGonigle, T.P., Miller ,M. H., Evans, D. G., Fairchild, G. L. and Swan, J. A. (1990). A new method which gives an objective measure of colonization ofroots by vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi. NewPhytol 1153: 495-501.

10. Brundrett, M. M. L. and Peterson, L.(1994). Practical methods in mycorrhiza research. Mycologue Publication,University of Guelph, Canada.

11. Clapp J. P.,Young J. P. W., Merryweather J. W. and Fitter A. H.. (1995).Diversity of Fungal Symbionts in Arbuscular Mycorrhizas from a Natural Community. NewPhytol 130(2): 259-265.