知識(shí)回顧定量蛋白質(zhì)組學(xué)一、無標(biāo)定量（相對(duì)定量）1.概念2.原理參考文獻(xiàn)3.理論基礎(chǔ)方法一方法二4.流程5.特點(diǎn)二、有標(biāo)定量1.概念2.原理3.種類4. ITRAQ1）參考文獻(xiàn)2）原理3）ITRAQ4）實(shí)驗(yàn)流程5）峰譜結(jié)果6）特點(diǎn)5、SILAC1）基本原理和流程2）參考文獻(xiàn)3）優(yōu)勢(shì)

知識(shí)回顧

我們先來回顧以下蛋白質(zhì)組學(xué)bottom up的流程

先將蛋白用胰酶酶，酶切肽段上質(zhì)譜檢測(cè)，搜庫軟件搜庫，數(shù)據(jù)分析

定量蛋白質(zhì)組學(xué)

對(duì)處不同時(shí)期、不同條件下蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化的研究，識(shí)別功能模塊和路徑，監(jiān)控疾病的生物標(biāo)志物，這些研究都需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和定量
參考文獻(xiàn)（Quantitative mass spectrometry in proteomics : a critical review）

文章展現(xiàn)了：代謝標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記、合成標(biāo)準(zhǔn)肽、無標(biāo)定量（lable free)，雖然文章時(shí)間較早，但是對(duì)于不同方法的比較描述很清楚

一、無標(biāo)定量（相對(duì)定量）

1.概念

無標(biāo)記定量法是一種質(zhì)譜分析方法，目的是測(cè)定兩個(gè)或兩個(gè)以上生物樣品中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，不使用含有穩(wěn)定同位素的化合物蛋白質(zhì)。

2.原理參考文獻(xiàn)

基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)策略和方法研究進(jìn)展.  中國(guó)科學(xué) :  生命科學(xué) , 2015.

3.理論基礎(chǔ)

方法一

基 于離子流色譜峰(extracted ion current, XIC)的定量算 法（MaxQuant）

在保留時(shí)間(retention time, RT)軸上, 根據(jù)肽段母 離子的質(zhì)荷比提取不同保留時(shí)間下的相應(yīng)同位素峰 簇的信號(hào)強(qiáng)度, 重構(gòu) XIC, 并利用 XIC 的面積或信號(hào) 加和等指標(biāo)作為肽段的定量結(jié)果.（Maxquant)

方法二

譜圖計(jì)數(shù)（Spectral Counting）方法。

一個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的二級(jí)譜圖數(shù)目越多，豐度越高

4.流程

5.特點(diǎn)

無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。蛋白質(zhì)無需標(biāo)記，樣本所需蛋白總量少，實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)低；無需復(fù)雜的標(biāo)記步驟，操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短；適用范圍廣：不受樣品條件限制，幾乎可對(duì)任何物種的各類蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定
要求高：對(duì)液相色譜分離及串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的穩(wěn)定性和重復(fù)性要求較高，需要有足夠的技術(shù)重復(fù)以確證結(jié)果的可靠性。

二、有標(biāo)定量

1.概念

有標(biāo)定量(stable isotopic labeling quantification) 是指利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記樣本后再進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)譜 鑒定與定量分析的方法.

2.原理

相同肽段的不 同標(biāo)記狀態(tài)會(huì)在同一張質(zhì)譜圖中形成具有固定質(zhì)量 差的同位素峰, 利用這些同位素峰可以計(jì)算出同一 肽段在每種標(biāo)記狀態(tài)中的豐度信息與相應(yīng)的豐度 比值.

3.種類

4. ITRAQ

iTRAQ - isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation

1）參考文獻(xiàn)

（Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents）

2）原理

ITRAQ試劑是可與氨基連接胺標(biāo)記同重元素。在一級(jí)質(zhì)譜中任何一種ITRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比，從而表現(xiàn)為同一個(gè)質(zhì)譜峰。在二級(jí)質(zhì)譜中，ITRAQ試劑中的平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比（114~121）的峰，因此根據(jù)波峰的高度個(gè)面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異。

3）ITRAQ

ITRAQ試劑包括3部分

4）實(shí)驗(yàn)流程

5）峰譜結(jié)果

1. MS 一級(jí)譜，某一個(gè)蛋白分子量為1352.84

1. MS/MS 二級(jí)譜
   

   

3.信號(hào)離子，分子量為114.1、115.1、116.1、117.1 的信號(hào)離子，這個(gè)四個(gè)峰的峰面積比值為所標(biāo)記的不同樣本中的蛋白量的比值。

6）特點(diǎn)

優(yōu)勢(shì)：靈敏度高，定量比較準(zhǔn)確
缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜

5、SILAC

細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)

1）基本原理和流程

利用含輕、中或重型同位素標(biāo)記的必需氨基酸（主要是Lys和Arg）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，來標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)，一般培養(yǎng)5-6代，細(xì)胞中的蛋白質(zhì)將都被同位素標(biāo)記。不同處理的蛋白樣品等量混合，經(jīng)SDS-PAGE分離，切膠，酶消化，LC-MS/MS分析即可得到有關(guān)蛋白的定量及定性結(jié)果。

細(xì)胞生長(zhǎng)過程中標(biāo)記

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的標(biāo)記

2）參考文獻(xiàn)

（ Anna E  Merrill , Joshua J  Coon, Quantifying proteomes and their post-translational modifications by stable isotope label-based mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 17, 1-8 (2013).）

3）優(yōu)勢(shì)