定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有非標(biāo)定量（Label-free）和標(biāo)記定量（iTRAQ/TMT、SILAC和同位素二甲基標(biāo)記）。這期我們介紹這幾種定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法：

一 iTRAQ/TMT

iTRAQ/TMT定量是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，該技術(shù)的核心原理是多肽標(biāo)記和定量，從而簡(jiǎn)化了定量的復(fù)雜性，最終通過(guò)多肽定量值回歸到蛋白的定量值，從而最終測(cè)定出不同樣本之間蛋白質(zhì)的差異。

iTRAQ/TMT定量不依賴樣本，可檢測(cè)出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量準(zhǔn)確，并可同時(shí)得出鑒定和定量的結(jié)果，特別適用于采用多種處理方式或來(lái)自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析。

iTRAQ和TMT的結(jié)構(gòu)與區(qū)別，iTRAQ和TMT是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，它們均采用體外標(biāo)記的方法，利用同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)酶解后產(chǎn)生的多肽，對(duì)兩個(gè)或多個(gè)樣本，在全蛋白質(zhì)組層面上展開(kāi)相對(duì)定量分析。二者區(qū)別只是不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)記試劑盒（iTRAQ是AB SCIEX研發(fā)，TMT是Thermo Fisher研發(fā)），在標(biāo)記規(guī)格（iTRAQ是4標(biāo)和8標(biāo)的；TMT是2標(biāo)、6標(biāo)以及10標(biāo)的）、標(biāo)簽分子結(jié)構(gòu)上有些許差異，其他原理基本一樣。

iTRAQ/TMT試劑均由三部分組成：質(zhì)量報(bào)告基團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化基團(tuán)和氨基反應(yīng)基團(tuán)。相應(yīng)的標(biāo)記數(shù)對(duì)應(yīng)著相應(yīng)個(gè)數(shù)的不同分子量的質(zhì)量報(bào)告基團(tuán)，比如TMT10標(biāo)有10種不同的分子量質(zhì)量報(bào)告基團(tuán)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化基團(tuán)也10有種不同的分子量，與不同的報(bào)告基團(tuán)搭配，能保證被標(biāo)記的不同來(lái)源的同一肽段在一級(jí)質(zhì)譜中具有相同的質(zhì)荷比；氨基反應(yīng)基團(tuán)能與肽段N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基發(fā)生共價(jià)連接使肽段連上標(biāo)記。一級(jí)質(zhì)譜中，任何一種TMT試劑標(biāo)記的不同樣品中的同一肽段表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比；二級(jí)質(zhì)譜中，可切割鍵（箭頭所指）斷裂釋放出TMT報(bào)告離子，在質(zhì)譜低質(zhì)量區(qū)產(chǎn)生了10個(gè)TMT報(bào)告離子峰，其強(qiáng)度反應(yīng)了該肽段在不同樣品中的相對(duì)表達(dá)量信息，另外二級(jí)質(zhì)譜中的肽段碎片離子峰質(zhì)荷比反應(yīng)了該肽段的序列信息；這些質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，可得到蛋白質(zhì)的定性和相對(duì)定量信息。

由于iTRAQ或TMT技術(shù)上的限制，最多標(biāo)記10個(gè)樣品，我了解的公司可以做到11標(biāo)，所以，當(dāng)樣品數(shù)超過(guò)10個(gè)的時(shí)候就需要設(shè)置內(nèi)參，以矯正不同批次之間的批次差異（搭橋技術(shù)）。比如：做18個(gè)樣品，則需要做成兩組10標(biāo)的進(jìn)行上機(jī)，每組9個(gè)樣品加1個(gè)內(nèi)參（內(nèi)參是多個(gè)樣品的混樣或標(biāo)準(zhǔn)品），總共需要做的樣品數(shù)就是9+9+1+1=20個(gè)。

在通量方面一般iTRAQ 4標(biāo)>TMT 6標(biāo)>iTRAQ8標(biāo)>TMT 10標(biāo)，當(dāng)然這個(gè)跟公司的實(shí)力也有關(guān)系，也有iTRAQ4標(biāo)>TMT 6標(biāo)>TMT 10標(biāo)>iTRAQ 8標(biāo)的出現(xiàn)。

二 SILAC

SILAC定量的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(中性或重型)標(biāo)記的必需氨基酸取代細(xì)胞培養(yǎng)基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng)5-6個(gè)倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。

不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對(duì)定量，屬于體內(nèi)代謝標(biāo)記法。

SILAC屬于體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，更接近樣品真實(shí)狀態(tài)，標(biāo)記效率高達(dá)100%，且標(biāo)記效果穩(wěn)定，不僅適合于進(jìn)行全細(xì)胞蛋白分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量，每個(gè)樣本只需要幾十微克的蛋白量。

SILAC定量適用于活體培養(yǎng)細(xì)胞的分析，對(duì)多個(gè)樣品或同一樣品不同條件下全細(xì)胞蛋白或亞細(xì)胞蛋白進(jìn)行差異比較。

三 Label-free

Label-free定量，即非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，不需要對(duì)比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

Label-free定量不需要標(biāo)記處理，操作簡(jiǎn)單，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)差異定量，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性、重復(fù)性要求較高，準(zhǔn)確性也較標(biāo)記定量差。因此，Label-free技術(shù)適合于大樣本量的定量比較，以及對(duì)無(wú)法用標(biāo)記定量實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

最后我們能來(lái)梳理下這三種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：

Label free無(wú)需同位素標(biāo)記，不受樣本條件的限制，定性沒(méi)有問(wèn)題，但是定量的準(zhǔn)確性不高，會(huì)受到質(zhì)譜重復(fù)性等因素的影響，對(duì)于組織本身蛋白量不高，可以選擇Label free，畢竟價(jià)格比較便宜，另外對(duì)于想得到處理組和對(duì)照組蛋白有無(wú)的情況，只能選擇Label free。

SILAC體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100％，定量重復(fù)性好，用量少，適合于膜蛋白的鑒定和定量，最大的優(yōu)點(diǎn)，活體標(biāo)記，更接近樣品真實(shí)狀態(tài)，缺點(diǎn)也很明顯只適用于活體培養(yǎng)的細(xì)胞，而且周期長(zhǎng)，花費(fèi)大，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)研究中常用的組織樣品，體液樣品等無(wú)法分析，對(duì)于動(dòng)物模型的標(biāo)記成本太大，無(wú)法實(shí)現(xiàn)。

iTRAQ/TMT的覆蓋度高、靈敏度高、重復(fù)性好。但是在混標(biāo)上機(jī)時(shí)要充分考慮樣品的情況，樣品數(shù)量較多時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)會(huì)較為復(fù)雜。相對(duì)于 SILAC 體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)漫長(zhǎng)的同位素氨基酸替換周期，基于 iTRAQ/TMT的體外標(biāo)記技術(shù)避免了前期漫長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)處理，極大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。所以iTRAQ/TMT適用于任何類(lèi)型的樣本；一次最多能標(biāo)記10個(gè)樣本，優(yōu)點(diǎn)也很明顯通量高，有的物種像小麥可以定量到11000個(gè)蛋白（小編接手過(guò)的項(xiàng)目，嘿嘿）

三種技術(shù)的區(qū)別

這期就到這里，那我們下期介紹下樣品制備和疑難問(wèn)題解答！再見(jiàn)。