1. H014候選搭檔NAb P17的鑒定和表征

通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，我們先前鑒定了一種人源化治療性抗體H014，能夠通過(guò)識(shí)別RBD中的一個(gè)保守斑塊而交叉中和SARS-CoV-2和SARS-CoV。在動(dòng)物模型中，我們使用H014單藥治療可有效預(yù)防SARS-CoV-2感染。為了為理想的混合物選擇H014的伴侶，我們尋找了：(1)針對(duì)SARS-CoV-2的特異性抗體；(2)高度有效的；(3)與H014和RBD靶向不競(jìng)爭(zhēng)；(4)起源于人類(lèi)。在篩選研究中，我們以SARS-CoV-2重組RBD為靶點(diǎn)，針對(duì)全人源抗體庫(kù)(ST-ST-HuNAL, Fabformat, SanyouBio)，使用標(biāo)準(zhǔn)的固相免疫管篩選方法，產(chǎn)生了大量的多種抗體。經(jīng)過(guò)3輪搖選，我們篩選出80多個(gè)獨(dú)特序列對(duì)靶標(biāo)具有較強(qiáng)親和力的克隆作為鉛擊，將其構(gòu)建成全長(zhǎng)IgG1并通過(guò)ExpiCHO系統(tǒng)表達(dá)。在這些先導(dǎo)物中，P17抗體與SARS-CoV-2 RBD緊密結(jié)合，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)顯示其有效濃度(EC50)為29 pM的一半(圖S1)。為了研究P17的病毒特異性，我們表達(dá)并純化了重組SARS-CoV RBD進(jìn)行結(jié)合研究。表面等離子體共振(SPR)檢測(cè)結(jié)果表明，P17與SARS-CoV-2 RBD的結(jié)合高度為96 pM，但P17與SARS-CoV RBD沒(méi)有相互作用，表明P17具有SARS-CoV-2特異性(圖1a)。為了深入了解P17識(shí)別的表位，我們使用競(jìng)爭(zhēng)性SPR表位結(jié)合試驗(yàn)，將SARS-CoV-2 S三聚體上的抗原位點(diǎn)定位到H014，H014結(jié)合RBD一側(cè)的保守表位，不同于受體結(jié)合基序(RBM)。標(biāo)記為SARS-CoV-2 S三聚體的CM5傳感器先用H014飽和，再用P17淹沒(méi)，或者先用P17飽和，再用H014流過(guò)傳感器。雖然S三聚體已被第一抗體飽和(~600 RU為結(jié)合信號(hào))，但第二抗體仍能與S三聚體結(jié)合，結(jié)合信號(hào)高達(dá)1200 RU，這表明盡管這兩種抗體沒(méi)有變構(gòu)結(jié)合模式(圖S2)，P17識(shí)別的表位不同于與H014結(jié)合的表位(圖1b)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了P17對(duì)SARS-CoV-2的體外中和能力，免疫熒光染色結(jié)果表明，P17對(duì)SARS-CoV-2感染的預(yù)防作用呈劑量依賴(lài)性(圖S3)，而Huh7細(xì)胞的偽病毒中和試驗(yàn)(PSV)和Vero細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)50%斑塊減少中和試驗(yàn)(PRNT)均顯示P17在IC50和PRNT50值分別為165和195 pM時(shí)表現(xiàn)出更強(qiáng)的中和活性(圖1c, d)。值得注意的是，P17對(duì)SARS-CoV-2的中和活性是H014的200倍，P17和H014的混合物即使在病毒滴度更高的情況下也表現(xiàn)出適度的協(xié)同中和活性(圖1e)。雖然P17在偽分型中和試驗(yàn)中對(duì)SARS-CoV沒(méi)有抑制活性，但由于H014的交叉中和活性，P17和H014混合物在亞納米水平上對(duì)SARS-CoV偽病毒表現(xiàn)出強(qiáng)大的中和活性，表明這種混合物可能具有泛SARS-CoV保護(hù)作用(圖1f)。 

圖1 H014候選搭檔NAb P17的鑒定和表征

(a) P17與SARS-CoV-2 RBD和SARS-CoV RBD結(jié)合的親和力分析。(b) P17和H014競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SARS-CoV-2的SPR動(dòng)力學(xué)。P17在Huh7細(xì)胞中的偽病毒中和試驗(yàn)(c)和P17在Vero細(xì)胞中的PRNT中和SARS-CoV-2活性(d)。P17、H014的中和活性，以及抗SARS-CoV-2活病毒(e)和SARS-CoV假病毒(f)的不同濃度混合抗體的中和活性。

2. P17對(duì)SARS-CoV-2敏感小鼠的預(yù)防和治療作用

考慮到P17在pM濃度下出色的中和活性，我們接下來(lái)試圖評(píng)估P17在新建立的hACE2小鼠模型中的體內(nèi)保護(hù)作用。鼻內(nèi)接種SARS-CoV-2(5×104PFU)可使病毒在hACE2小鼠的氣管和肺部大量復(fù)制，接種5天后我們觀察到輕度肺病理。我們?cè)趆ACE2小鼠接種SARS-CoV-2前12小時(shí)或接種后4小時(shí)分別給予P17，分別為預(yù)防(P)或治療(T)(圖2a)，在治療模式中，小鼠按每公斤體重20 mg一次性腹腔注射P17可顯著減少SARS-CoV-2病毒，與對(duì)照組相比，其肺和氣管中的RNA負(fù)載(圖2b, c)；而在預(yù)防模式下，給予兩劑P17的效果更顯著，導(dǎo)致肺部和氣管的病毒載量分別減少193倍和412倍(圖2b, c)。與H014相比，更低劑量(20 mg/kg vs 50mg/kg)的P17在減少病毒RNA方面產(chǎn)生了類(lèi)似的保護(hù)作用；同樣，RNAscope進(jìn)行的原位雜交(ISH)試驗(yàn)在對(duì)照組小鼠中檢測(cè)到大量SARS-CoV-2特異性RNA，而在P17給藥小鼠中檢測(cè)到的病毒RNA信號(hào)很少(圖2d)。免疫熒光染色顯示，P17給藥后，只檢測(cè)到少量SARS-CoV-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞，而PBS處理的小鼠沿氣道肺泡內(nèi)病毒蛋白表達(dá)豐富(圖2e)。值得注意的是，P17治療組的所有小鼠在5 dpi時(shí)肺/氣管中不再有傳染性病毒，這是通過(guò)肺組織勻漿的空斑試驗(yàn)測(cè)定的(圖2f)；更重要的是，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，PBS對(duì)照組hACE2人源化小鼠在第5天出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚和特異性血管系統(tǒng)損傷(圖2g)。相比之下，P17治療組小鼠肺只出現(xiàn)非常輕微的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞未見(jiàn)明顯病變或局灶性出血(圖2g)。這些結(jié)果表明，P17是一種有效的中和抗體，可以有效保護(hù)小鼠免受SARS-CoV-2的侵襲，此外，在建立的SARS-CoV-2小鼠適應(yīng)毒株MASCp6小鼠模型中，P17和H014的混合物的保護(hù)效果提高了2-10倍(圖2h, i)。

圖2 P17的預(yù)防和治療效果

(a) P17在兩個(gè)SARS-CoV-2易感小鼠模型中的治療示意圖。(b)肺中的病毒RNA載量為5 dpi，以每克RNA副本的形式表達(dá)。(c) 病毒在氣管中的RNA載量為5 dpi，以RNA拷貝數(shù)/克表示。(d) 用SARS-CoV-2特異性探針檢測(cè)SARS-CoV-2基因組RNA。(e)SARS-CoV-2特異性抗體免疫小鼠肺染色。(f) hACE2小鼠肺中病毒載量為5 dpi時(shí)，用空斑法測(cè)定。(g) 5 dpi時(shí)小鼠肺組織病理學(xué)特征。

3. SARS-CoV-2三聚體S與P17復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

為了準(zhǔn)確定義P17抗原表位，我們利用單粒子低溫電鏡對(duì)P17 Fab片段與SARS CoV-2 S外結(jié)構(gòu)域三聚體之間的復(fù)合物進(jìn)行了表征。對(duì)復(fù)合物的低溫電子顯微鏡表征顯示抗體的充分占用，其中一個(gè)Fab與同型三聚體S的每個(gè)RBD結(jié)合(圖3a)。與之前的研究類(lèi)似，3D分類(lèi)顯示復(fù)合物采用兩種截然不同的構(gòu)象狀態(tài)，分別對(duì)應(yīng)一個(gè)RBD open +兩個(gè)RBD closed(狀態(tài)1)和兩個(gè)RBD open +一個(gè)RBD closed(狀態(tài)2) (圖3a)。我們?cè)?.6和3.8 A分辨率下分別得到了狀態(tài)1和狀態(tài)2的SARS-CoV-2-P17復(fù)合物的不對(duì)稱(chēng)重構(gòu)(圖S4-S7)。RBD-P17區(qū)域的構(gòu)象遷移率代表了構(gòu)象的動(dòng)態(tài)連續(xù)體，限制了綁定接口的映射質(zhì)量(圖S5)。為了提高綁定接口的分辨率，我們采用優(yōu)化的“基于塊的”重構(gòu)方法進(jìn)行局部細(xì)化，這導(dǎo)致局部分辨率提高到3.9 A，使交互模式的可靠分析(圖S5-S7和表S1)。

P17識(shí)別受體結(jié)合基序(RBM)上的構(gòu)象表位，僅涉及蛋白-蛋白接觸，這與H014存在時(shí)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析的結(jié)果一致(圖1b)。從理論上講，SARS-CoV-2 S三聚體的糖基化可能不會(huì)影響P17與P17和H014混合物的結(jié)合和保護(hù)作用，與H014的表位只有在RBD“開(kāi)放”時(shí)才能被訪問(wèn)不同，P17的表位在開(kāi)放和封閉的RBD狀態(tài)下都可以訪問(wèn)，這與Fab與S三聚體的化學(xué)計(jì)量結(jié)合是一致的(圖3a，圖S8)。正如預(yù)期的那樣，在復(fù)雜結(jié)構(gòu)中我們可以觀察到由于“閉合”和“打開(kāi)”狀態(tài)切換而產(chǎn)生的隨機(jī)RBD不同角度的旋轉(zhuǎn)(圖3b，圖S8)。P17通過(guò)靶向RBM與各種狀態(tài)的RBD緊密結(jié)合，表明在與宿主細(xì)胞的整個(gè)動(dòng)態(tài)交互過(guò)程中，P17受到了強(qiáng)烈的干擾，P17的足跡占S單個(gè)單體的~900 A2的面積，輕鏈和重鏈的變量域分別占相互作用界面的~30%和70% (圖3c-e)。

4. P17抗原表位

接下來(lái)，我們對(duì)P17 Fab與S結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析以確定抗體的表位。有趣的是，有趣的是，除了靶向RBM外，與“閉合”RBD結(jié)合的P17通過(guò)第四個(gè)暴露于溶劑的環(huán)，即DE環(huán)（也稱(chēng)為L(zhǎng)4環(huán)，與CDRL1和CDRL2相鄰，CDRL1和CDRL2連接在抗體上的D和E鏈）與相鄰RBD（殘基374–376構(gòu)成β2的上游環(huán)）從輕鏈接觸(圖3f-h，圖S9)。這些S上的接觸殘基可能代表P17的“非必需”或“動(dòng)態(tài)”表位。考慮到特定的交互模式涉及到兩個(gè)相鄰RBD的形成聯(lián)系，P17的能力在某種程度上連接兩個(gè)相鄰單體，這可能限制的發(fā)展所需的構(gòu)象變化病毒的生命周期從十二postfusion階段(圖3 a、g)。

P17主要通過(guò)5個(gè)CDR環(huán)與RBD相互作用：CDRL1(殘基29-33)、CDRL3(殘基90-96)、CDRH1(殘基30-33)、CDRH2(殘基50-59)和CDRH3(殘基99-106)(圖3c, h)，必需的P17表位包含14個(gè)位于RBM上的殘基。其中有11個(gè)殘基(78.6%)在SARS-CoV和SARS-CoV-2之間不保守，解釋了其病毒特異性結(jié)合和中和活性(圖S10)。SARS-CoV的m396、80R和F26G19等抗原表位以及P17的抗原表位表明，SARS-CoV-2的RBM核心(465-495殘基；SARS-CoV中的455-485殘留物)主要更可能是病毒特異性的。L455、F456、V483、F486、C488、Y489、F490在輕鏈的RBM、Y32、Y92和重鏈的Y32、H35、Y59、H99、M103上形成疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)，使其緊密結(jié)合成為可能(圖3d, f，表S2)；此外，廣泛的親水性相互作用進(jìn)一步加強(qiáng)了RBD-P17的相互作用(圖3d, f，表S2)。最近，在目前流行的菌株中報(bào)道了一些RBD的點(diǎn)突變，P17與這些RBD突變體(N354D/D364Y,V367F, R408I和W436R)具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力，表明P17對(duì)大多數(shù)流行菌株具有廣泛的中和潛力(圖S10-S11)。 

圖3 SARS-CoV-2 S三聚體與P17復(fù)合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)

(a) 具有一個(gè)開(kāi)放和兩個(gè)封閉RBDs的狀態(tài)1結(jié)構(gòu)(左)和具有兩個(gè)開(kāi)放和一個(gè)封閉RBDs的狀態(tài)2結(jié)構(gòu)(右)的正交視圖。(b) 由于“閉合”和“打開(kāi)”狀態(tài)之間的切換，隨機(jī)的RBD旋轉(zhuǎn)具有不同的角度。(c) SARS-CoV-2 RBD(粉紅色)與P17 Fab復(fù)合體結(jié)構(gòu)的卡通表現(xiàn)。(d) P17 Fab與SARS-CoV-2 RBD的結(jié)合袋。(e) SARS-CoV-2 RBD的P17表位。(f) P17 Fab與SARS-CoV-2 RBD的相互作用。(g) 與“閉合的”RBD結(jié)合的P17也與相鄰的S接觸RBD。(h) P17和SARS-CoV-2 RBD之間接口的詳細(xì)信息。

5. P17與H014的協(xié)同中和機(jī)制

此前，我們已經(jīng)證明，H014中和SARS CoV-2是通過(guò)空間位碰撞阻止病毒附著在ACE2受體上，盡管沒(méi)有針對(duì)RBM；而P17與RBM緊密結(jié)合，因此能夠通過(guò)使結(jié)合位點(diǎn)不可用來(lái)完全阻斷SARS CoV-2與ACE2的結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，P17能夠有效消除SARS-CoV-2 RBD和ACE2之間的相互作用(圖S12)。結(jié)構(gòu)分析顯示，對(duì)應(yīng)ACE2不可達(dá)狀態(tài)的“封閉”RBD構(gòu)象仍然能夠與P17結(jié)合，表明SARS-CoV-2 S三聚體完全閉塞。為了功能性地驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們進(jìn)行了兩組SPR試驗(yàn)，首先將三聚體S暴露于P17，然后暴露于ACE2，或者反過(guò)來(lái)。可以預(yù)期的是，P17的結(jié)合完全阻斷了ACE2與SARS-CoV-2三聚體S的結(jié)合，并且由于P17與ACE2相比對(duì)SARS-CoV-2三聚體S的結(jié)合親和力更強(qiáng)，已經(jīng)結(jié)合到三聚體S的ACE2可以被剝離并被P17所取代（圖4a）。為了在基于細(xì)胞的病毒感染模型中進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，我們?cè)赩ero細(xì)胞中進(jìn)行了吸附前和吸附后抑制試驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，P17與SARS-CoV-2的孵育以劑量依賴(lài)性的方式阻止病毒附著到Vero細(xì)胞表面，并且已經(jīng)吸附到細(xì)胞表面的病毒顆?？梢栽诟邼舛认卤籔17完全剝離（圖4b）。SARS-CoV-2 RBD -ACE2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與SARS-CoV-2 RBD -ACE2復(fù)合體的結(jié)構(gòu)重疊，表明ACE2與其相鄰的兩個(gè)P17發(fā)生嚴(yán)重沖突，暗示P17會(huì)阻礙SARS-CoV-2 RBD與其ACE2受體的結(jié)合(圖4c)。由于P17的特異性結(jié)合模式，可能存在額外的中和模式，為了探討P17是否能在融合階段抑制SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞，我們以表達(dá)SARS-CoV-2 S的293T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以Vero-E6細(xì)胞為靶細(xì)胞，建立了S介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)。在效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后，表達(dá)SARS-CoV-2 S蛋白的細(xì)胞融合成一個(gè)大的多核合胞體，而用不同濃度的P17預(yù)處理效應(yīng)細(xì)胞，在很大程度上阻斷了合胞體的形成，表明P17能夠阻斷病毒膜融合（圖4d）。為了進(jìn)一步闡明P17在融合階段的能力，我們建立了體外膜融合實(shí)驗(yàn)，用胰蛋白酶和ACE2處理純化的SARS-CoV-2病毒粒子可以在酸性環(huán)境下觸發(fā)病毒與脂質(zhì)體的膜融合。與細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一致，P17可以有效地抑制ph依賴(lài)的SARS-CoV-2與脂質(zhì)體的融合，并以劑量依賴(lài)的方式，但H014即使在高濃度下也不能這樣做。有趣的是，P17在低濃度H014存在時(shí)表現(xiàn)出增強(qiáng)的抑制能力，這與它們的協(xié)同中和活性一致(圖4e和1e)。 

圖4 P17與H014的協(xié)同中和機(jī)制

(a) P17和ACE2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SARS-CoV-2的SPR動(dòng)力學(xué)。(b) 吸附前和吸附后抑制試驗(yàn)。(c) P17 Fab和ACE2在與SARS-CoV-2結(jié)合時(shí)發(fā)生沖突。(d) P17抑制S蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合。(e) 不同濃度的P17阻斷ACE2介導(dǎo)的SARS-CoV-2與脂質(zhì)體的融合。

6. 抗體組合中的協(xié)同性是通過(guò)S1屏蔽和鎖定構(gòu)象來(lái)實(shí)現(xiàn)的

H014與P17合用對(duì)SARS-CoV-2具有協(xié)同作用。為了揭示雙抗體組合協(xié)同效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，我們對(duì)SARS-CoV-2 S三聚體與H014和P17 Fabs復(fù)合物進(jìn)行了低溫電鏡分析，三元配合物的低溫電鏡結(jié)構(gòu)整體分辨率可達(dá)3.2 A(圖5a及圖S6)。與大多數(shù)對(duì)載脂蛋白SARS-CoV-2 S三聚體或其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究不同，在觀察到與0–3個(gè)RBD開(kāi)放相對(duì)應(yīng)的各種構(gòu)象狀態(tài)時(shí)，只有一個(gè)構(gòu)象狀態(tài)與所有3 RBD開(kāi)放是我們?cè)趶?fù)雜的結(jié)構(gòu)中觀察到NAbs混合物的S（圖5a）。這一觀察結(jié)果也與SARS-CoV-2 S單獨(dú)與H014或P17復(fù)合物所獲得的結(jié)構(gòu)見(jiàn)解大不相同（圖3），總共有3份Nab混合物（3個(gè)H014和3個(gè)P17）綁定到一個(gè)S三聚體上。3個(gè)P17 Fab結(jié)合在每個(gè)RBD的頂部，與ACE2重疊并覆蓋SARS-CoV-2 RBD的接觸區(qū)域，形成“帽”層（shield-1），3個(gè)H014Fab結(jié)合在每個(gè)RBD的側(cè)面，填充RBD和相鄰NTD之間的空間，在蓋層下方建造一個(gè)交錯(cuò)排列的外層（shield-2）（圖5a）。這兩層蛋白起到了盾牌的作用，屏蔽了S1的大部分區(qū)域，阻止了SARS-CoV-2 RBD與宿主細(xì)胞受體和細(xì)胞表面蛋白酶相互作用的可能性(圖5a)，此外，6個(gè)Fab的協(xié)同作用可以阻止RBD的關(guān)閉，抑制S1進(jìn)一步的構(gòu)象變化，而這些變化是啟動(dòng)病毒融合過(guò)程所必需的。這些結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)解釋了混合抗體中和SARS-CoV-2機(jī)制的分子基礎(chǔ)，并為H014和P17在中和SARS-CoV-2時(shí)觀察到的協(xié)同作用提供了合理性依據(jù)?；旌衔镏械膬蓚€(gè)NAbs可以同時(shí)結(jié)合RBD的不同區(qū)域；一種識(shí)別出SARS冠狀病毒和SARS-CoV-2之間更保守的斑塊，而另一種針對(duì)SARS-CoV-2特異性斑塊(圖5b)，表明這種混合物可能對(duì)泛SARS冠狀病毒株提供有效和廣泛的保護(hù)，此外，由具有非競(jìng)爭(zhēng)活性的抗體制成的混合物，如在這種混合物中，至少有一種抗體識(shí)別高度保守的表位，理論上可以提供額外的保護(hù)，以防止任何可能發(fā)生的病毒逃逸中和。 

圖5 P17和H014抗體混合物協(xié)同作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

(a) SARS-CoV-2 S三聚體與P17和H014復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。(b) P17和H014結(jié)合RBD的不同區(qū)域。(c-e) 基于P17和H014抗體混合物的多種潛在候選混合物。

在此，我們應(yīng)用合理的NAb篩選策略，結(jié)合基于SPR的交叉競(jìng)爭(zhēng)分析和冷凍電鏡分析，開(kāi)發(fā)出新一代人NAb混合物，可產(chǎn)生廣泛而有效的抗泛SARS冠狀病毒的保護(hù)作用。本研究中描述的抗體混合物靶向SARS-CoV-2和SARS-CoV的峰值，識(shí)別兩個(gè)不同中和簇的RBD，并通過(guò)阻斷與宿主細(xì)胞受體的連接以及干擾病毒膜融合來(lái)中和病毒感染，從而賦予效力以及額外的保護(hù)，防止病毒中和逃逸。此外，我們對(duì)RBD上存在的各種中和簇的結(jié)構(gòu)分析以及對(duì)其他假定抗體伙伴的識(shí)別，對(duì)開(kāi)發(fā)治療COVID-19的最優(yōu)化抗體治療組合具有指導(dǎo)意義，本篇文章揭示的naba -抗原相互作用的原理也可以促進(jìn)設(shè)計(jì)治療性混合物對(duì)抗其他病毒。