Xiaojie Zhu 1 , Qi Liu 2 , Lanying Du 3 , Lu Lu 1 , Shibo Jiang 4 1 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China 2 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China; Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Basic Medicine, Dali University, Dali, China 3 Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, USA 4 Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, Shanghai Medical College and Institute of Medical Microbiology, Fudan University, Shanghai, China; Lindsley F. Kimball Research Institute, New York Blood Center, New York, USA 關(guān)鍵詞: 病毒 SARS冠狀病毒 受體結(jié)合區(qū)域 突起蛋白 疫苗 摘要 10年前,嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒(SARS-CoV)造成了世界范圍的流行爆發(fā),其死亡率為10%。最近爆發(fā)的由中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)導(dǎo)致的類SARS的報道引起了人們密切關(guān)注,人們擔(dān)心SARS-CoV是否有可能經(jīng)實驗室逃逸或自然宿主而再次爆發(fā)。故而,研發(fā)有效并安全的SARS疫苗仍有必要?;谖覀円酝难芯浚覀冋J(rèn)為位于SARS-CoV spike(S)蛋白S1亞基的受體結(jié)合區(qū)(RBD)是研發(fā)SARS疫苗最重要的靶點。尤其是S蛋白的RBD含有關(guān)鍵中和區(qū)(CND),CND可以誘發(fā)強效的中和抗體反應(yīng)以及對SARS-CoV變異株的交叉保護。此外,以RBD為基礎(chǔ)的亞基疫苗有望比其他疫苗更安全,不會引起2型免疫反應(yīng)。本文將討論以RBD為基礎(chǔ)的SARS疫苗研發(fā)的關(guān)鍵進展,以及用同樣方法研發(fā)MERS-CoV疫苗的可能性。 導(dǎo)言2002年末,中國廣東省出現(xiàn)了新型人冠狀病毒(SARS-CoV)引起的重癥急性呼吸綜合征(SARS)。至2003年底,已經(jīng)播散至30多個國家,8096人受累,其中774例死亡(致死率約10%)(1-3)。盡管在2003年7月已控制住世界范圍SARS的流行,但2003年末至2004年初中國散發(fā)的病例報道(4)引起了人們的關(guān)注,人們擔(dān)心SARS-CoV 通過動物源性或?qū)嶒炇姨右荩?,6)導(dǎo)致SARS再次爆發(fā)。 最近有一種與SARS冠狀病毒密切相關(guān)的病毒—中東呼吸綜合征冠狀病毒—已經(jīng)被證實是導(dǎo)致類SARS爆發(fā)的病原體,該病毒在中東、歐洲、非洲造成的感染死亡率為55%。這些報道引起了關(guān)于SARS冠狀病毒是否可能復(fù)燃的關(guān)注,并且促進了有效安全的SARS疫苗發(fā)展,以便對付未來的任何SARS流行。 明確SARS-CoV spike蛋白上的受體蛋白結(jié)合區(qū)(RBD)及其在病毒進入靶細(xì)胞過程中的地位SARS-CoV是一種單鏈,不分節(jié)段,有包膜的正鏈RNA病毒。其基因組RNA包含29,736個核苷酸,基因組的前2/3(5′端)編碼非結(jié)構(gòu)RNA復(fù)制酶蛋白,基因組的后1/3(3′端)編碼結(jié)構(gòu)蛋白,包括刺突蛋白(S),包膜蛋白(E),膜蛋白(M),以及核衣殼(N)蛋白(11)。 SARS-CoV的S蛋白是一種I型跨膜糖蛋白(Env),在受體結(jié)合、膜融合、病毒入侵方面起重要的作用。SARS-CoV通過S蛋白與其細(xì)胞受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合而啟動入侵細(xì)胞的過程(12)。然后,病毒-ACE2復(fù)合體轉(zhuǎn)移至內(nèi)涵體。組織蛋白酶L抑制劑可以明顯抑制SARS-CoV的進入,提示S蛋白是通過內(nèi)涵體酸性蛋白酶(組織蛋白酶L)來激活其融合活性(13)。融合肽(FP)插入內(nèi)涵體膜后,S蛋白的七肽重復(fù)區(qū)1和2(HR1和HR2)相互結(jié)合形成一個六螺旋束(6-HB)核心,6-HB核心進而使病毒包膜和胞漿膜貼近以便融合。然后病毒RNA基因組釋放至胞漿(14,15)(圖1)。另外,SARS-CoV也可以類似HIV的方式經(jīng)胞漿膜融合進入靶細(xì)胞。SARS-CoV S蛋白的S1亞基與ACE2結(jié)合后,S2亞基通過將融合肽插入胞漿膜而改變構(gòu)象。HR2區(qū)域與HR1三聚體形成6-HB核心,導(dǎo)致病毒包膜和細(xì)胞胞漿膜融合(16)。 圖1 SARS-CoV入侵靶細(xì)胞模型。(A)SARS-CoV主要通過包內(nèi)體膜融合(左側(cè))還可通過胞漿膜融合(右側(cè))侵入靶細(xì)胞(16);(B)SARS-CoV S蛋白的HR1和HR2區(qū)構(gòu)成融合核心結(jié)構(gòu);融合核心是一個六螺旋束(6-HB),其中3個HR2α螺旋以傾斜反相平行的方式對于中心HR1三聚體表面的疏水區(qū)(17)。 隨后,RNA基因組以自己為模板合成全長及亞基因組長度的負(fù)鏈RNA,負(fù)鏈RNA又以自己為模板合成mRNA。病毒蛋白被翻譯出來并轉(zhuǎn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基中間腔室(ERGIC)內(nèi) (18)。胞漿的RNA基因組和N蛋白匯組成病毒核衣殼。經(jīng)胞吐作用,病毒粒子從細(xì)胞釋放出來(圖2)。 圖2 SARS-CoV的生命周期。SARS-CoV以結(jié)合病毒粒子開始生命周期,由S蛋白到靶細(xì)胞的ACE2受體(12),病毒粒子經(jīng)胞吞作用進入細(xì)胞。S蛋白改變構(gòu)象以利包內(nèi)膜融合并釋放RNA基因組到靶細(xì)胞。經(jīng)過復(fù)制和翻譯,病毒結(jié)構(gòu)、非結(jié)構(gòu)蛋白和基因組RNA收集到病毒粒子,病毒粒子再以囊泡轉(zhuǎn)運并釋放出靶細(xì)胞(5)。 SARS-CoV S蛋白由負(fù)責(zé)受體結(jié)合的S1表面亞基和介導(dǎo)膜融合的S2跨膜亞基組成??缃覵1亞基318-510殘基的一個片段便是最小RBD(19,20)。RBD包含一個環(huán)部位(424-494區(qū)域),命名為受體結(jié)合基序(RBM)(圖3A),它可以與受體ACE2完全接觸。有趣的是,RBM部位富含酪氨酸。直接接觸ACE2的14個RBM殘基中有6個是酪氨酸。RBM的兩個殘基,Asn479和Thr487,決定SARS疾病的進展以及SARS-CoV的嗜性(22,23)。替換這兩個殘基可以改變該病毒從動物到人或人與人之間的傳染性(圖3B)(21)。RBD部位的多個半胱氨酸殘基對維持SARS-CoV(21)和MERS-CoV(24)RBDs的功能性構(gòu)象有著重要的作用。 圖3 SARS-CoV S蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。(A)SARS-CoV S蛋白的功能區(qū);SP,信號肽;RBD,受體結(jié)合區(qū);RBM,受體結(jié)合基序;FP,融合肽;HR,七肽重復(fù)區(qū);TM,跨膜區(qū);CP,胞漿區(qū)。每個區(qū)域的殘基數(shù)字代表其在SARS-CoV S蛋白的位置。(B)RBD/ACE2復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)中,SARS-CoV S-RBD(綠)與 ACE2(紅) 的相互作用(12,20,21)。 RBD中可以誘導(dǎo)強效和廣泛的抗體中和作用的關(guān)鍵中和域(CND)我們的既往研究已經(jīng)顯示,從SARS患者及滅活SARS-CoV疫苗接種的動物中分離的抗血清可以與SARS-CoV S蛋白的RBD起明顯的反應(yīng),提示RBD擁有強效的中和作用(25)。免疫吸附耗盡患者或兔免疫血清中的RBD特異性抗體,導(dǎo)致血清介導(dǎo)的中和活性明顯下降(26)。SARS-CoV的抗血清提純的抗體明顯抑制RBD結(jié)合ACE2,并且親和純化的抗RBD抗體顯示出相對更強的中和感染性的能力(26,27)。所有這些結(jié)果提示,S蛋白的RBD含有CND,且RBD可進一步作為免疫原用于誘導(dǎo)產(chǎn)生針對SARS-CoV的中和抗體。 以前我們發(fā)現(xiàn)在RBD中單一的氨基酸置換,比如R441A,足以消除RBD在接種的小鼠和兔中誘導(dǎo)中和抗體的免疫原性,有R441A突變的RBD不能結(jié)合游離的和細(xì)胞相關(guān)的ACE2,提示RBD中RBM的一些關(guān)鍵殘基同樣也是CND中的關(guān)鍵殘基。不過,就像Ye et al.描述的,RBM的R453A突變清除了病毒的入侵能力,但保留了誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力,提示CND的某些殘基可能不參與RBD-受體相互作用(28)。 用嵌合IgG Fc的RBD(RBD-Fc)接種小鼠,從它們體內(nèi)分離出一組27個RBD特異性單克隆抗體(mAbs)。其中,mAbs 4D5和17H9可以識別RBD線性抗原表位,但未顯示出中和活性。采用競爭結(jié)合試驗,其余的25個RBD特異性mAbs可以根據(jù)他們識別的RBD抗原表位的構(gòu)象分為6組(i.e., Conf I-VI)(圖4)。我們發(fā)現(xiàn)只有識別Conf IV和V的mAbs可以有效的阻止RBD與ACE2結(jié)合,提示其抗原表位與RBD-ACE2相互作用有關(guān)。識別Conf I和II的mAbs對RBD與ACE2結(jié)合沒有明顯影響。但它們?nèi)跃哂袕娦У闹泻突钚?,提示這些mAbs能通過RBD-ACE2相互作用以外的途徑抑制SARS-CoV感染(27)。這些發(fā)現(xiàn)顯示SARS-CoV S蛋白RBD含有多種構(gòu)象表位,可以導(dǎo)致強效的中和反應(yīng),并且可以進一步作為靶點來研發(fā)SARS疫苗。 圖4 競爭結(jié)合試驗明確的RBD特異性mAbs的特異性抗原抗原。競爭結(jié)合試驗用生物素標(biāo)記的mAbs作為探針,明確可以識別RBD不同構(gòu)象的抗原抗原的mAbs特征。例如,mAbs 10E7和45B5生物素化后,則可測定結(jié)合10E7-biotin和45B5-biotin的25構(gòu)象特異性mAbs對RBD的的抑制活性。24H8和31H12均可有效阻滯10E7-biotin與RBD結(jié)合,31H12也可以抑制45B5-biotin與RBD結(jié)合。這些結(jié)果顯示mAbs 24H8和10E7享有同樣的抗原抗原(Conf I),而31H12能結(jié)合10E7和45B5均能識別的抗原抗原(Conf II)。同理,這25個構(gòu)象特異性mAbs可以分到6個不同的競爭組(Conf I-VI)(27)。 以RBD為基礎(chǔ)的SARS疫苗盡管以滅活病毒、DNA、病毒載體為基礎(chǔ)的試驗疫苗可以誘導(dǎo)有效的中和抗體反應(yīng),但他們的安全性在進一步研究中是最大的問題。一種雙滅活的SARS-CoV疫苗已證明可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞增多及免疫病理學(xué)改變(29)。該滅活疫苗中SARS-CoV的核衣殼蛋白(NP)可對此不良后果負(fù)責(zé)(30,31)。全長S蛋白可能也不安全。例如,包含重組S蛋白的試驗疫苗在接種動物身上能引起Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(32)或一些免疫增強反應(yīng)(33)。 基于我們以往的研究,我們相信以RBD為基礎(chǔ)的SARS疫苗是最有效和最安全的。首先,我們已經(jīng)證實重組了人類IgG Fc片段的RBD(RBD-Fc)能在哺乳動物細(xì)胞中表達,并能在免疫小鼠和兔子的體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生強效的中和抗體(34)。其次,在哺乳動物(293T)細(xì)胞、昆蟲(Sf9)細(xì)胞,以及E. Coli重組表達的無Fc片段的RBD, 均誘導(dǎo)高效的中和抗體反應(yīng),并在小鼠身上對SARS-CoV產(chǎn)生完全的保護免疫。第三,一個在中國倉鼠卵巢(CHO)-K1細(xì)胞表達的219片段(殘基318-536)RBD蛋白以及一個在CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達的193片段(殘基318-510)(RBD193-CHO)可以誘導(dǎo)很強的細(xì)胞及體液免疫反應(yīng),對所有免疫的小鼠都能產(chǎn)生保護作用(35,36)。第四,一種以腺伴隨病毒(rAAV)為基礎(chǔ)重組的RBD(RBD-rAAV)疫苗能在肌注疫苗的BALB/c小鼠身上誘導(dǎo)產(chǎn)生有中和活性的體液免疫反應(yīng)(37)。RBD-rAAV疫苗滴鼻使用比肌注能誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的SARS-CoV特異性系統(tǒng)及粘膜免疫反應(yīng)(38)。第五,初始給予RBD-rAAV疫苗,并以T細(xì)胞抗原決定基的RBD特異性肽加強能明顯提高抗SARS-CoV的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)(39)。第六,以RBD為基礎(chǔ)的SARS疫苗能在動物模型上誘導(dǎo)產(chǎn)生具有長期中和活性和長期保護性免疫的高滴度S特異性抗體(40)。所有這些結(jié)果提示,以RBD為基礎(chǔ)的疫苗作為有效和安全的疫苗,對預(yù)防SARS-CoV感染及在將來控制SARS復(fù)發(fā)流行方面有良好的研發(fā)前景。 結(jié)論與前景結(jié)合最近MERS-CoV引起的類SARS疾病的出現(xiàn)以及未來SARS復(fù)發(fā)的可能,研發(fā)有效、安全的針對SARS-CoV的疫苗有很大意義。我們過去的研究已經(jīng)顯示,SARS-CoV S蛋白的S1亞基上的RBD包含有CND,可以誘導(dǎo)強有力的體液及細(xì)胞免疫反應(yīng),尤其是交叉中和抗體和強有力的保護免疫。所以,以RBD為基礎(chǔ)的疫苗對研發(fā)作為將來有效的SARS疫苗值得考慮。進而,這種策略可以為針對其他含I型膜融合蛋白的包膜病毒感染疫苗的研發(fā)提供借鑒,這些病毒包括H7N9病毒(41-43)和MERS-CoV(7,24)。 最近,Chan等(44)用中和抗體試驗和免疫熒光方法檢測到恢復(fù)期SARS患者收集的血清可能含對MERS-CoV有交叉反應(yīng)的抗體。利用生物信息學(xué)分析,他們推測誘導(dǎo)交叉反應(yīng)抗體的B細(xì)胞抗原決定基可能位于MERS-CoV的S2亞基HR2區(qū)域。不久前,我們發(fā)現(xiàn)SARS-CoV S蛋白RBD特異性mAbs未顯示出針對MERS-CoV的交叉反應(yīng)或交叉中和活性,提示SARS-CoV 和MERS-CoV S蛋白RBD可能不包含誘導(dǎo)交叉活性抗體反應(yīng)的抗原決定基(45)。故而,計劃并研發(fā)針對MERS-CoV的以RBD為基礎(chǔ)的疫苗,需借鑒我們以RBD為基礎(chǔ)針對SARS疫苗的一些經(jīng)驗路徑。 致謝本研究受中國973計劃(#2012CB519001)基金支持,中國科學(xué)技術(shù)部,香港,澳門,臺灣合作計劃(201200007673),及美國NIH(R01 AI098775)。 聲明:作者宣稱沒有利益沖突。 參考文獻Zhong NS, Zheng BJ, Li YM et al. 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(翻譯者:李云雷) Cite this article as: Zhu X, Liu Q, Du L, Lu L, Jiang S. Receptor-binding domain as a target for developing severe acute respiratory syndrome vaccines. J Thorac Dis 2013;5(S2):S142-S148. doi: 10.3978/j.issn.2072-1439.2013.06.06
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