編譯：豆幾，編輯：謝衣、江舜堯。

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本文旨在研究葡萄提取物（GE）作為膳食干預(yù)劑，對代謝、激活棕色脂肪組織和腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響和探索相互之間的相關(guān)性。研究人員首先使用4周齡的C57BL/6Cnc雄性小鼠，通過飼喂高脂飼料建立高脂小鼠模型（HFFD），外加在飲水中添加1% GE進(jìn)行膳食干預(yù)(HFFD+GE)。通過分析小鼠體重、臟器組織重量、脂肪和肝臟組織切片、血清中葡萄糖和膽固醇含量、葡萄糖耐量和胰島素抵抗試驗，評價GE抵抗肥胖的效果和對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響。然后，監(jiān)測小鼠飲食攝入量、能量攝入量、能量吸收量、能量消耗量、運動量、氧氣消耗量和二氧化碳排放量，通過分析數(shù)據(jù)評價GE對小鼠能量代謝的影響。通過ELISA檢測小鼠血清中炎癥因子的含量，qPCR檢測小鼠白色脂肪組織和肝臟中炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平，肝臟組織切片結(jié)果的分析，評價GE對小鼠炎癥的影響。接著，對小鼠盲腸中的糞便樣品進(jìn)行16S rRNA高通量測序分析腸道微生態(tài)系統(tǒng)（GM），評價GE對腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響。運用UPLC/ESI-MS檢測小鼠血清樣品中膽汁酸（BA）的種類和含量，評價GE對小鼠BA代謝的影響，并聯(lián)合腸道微生態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。隨后，研究人員對小鼠棕色脂肪組織（BAT）展開研究，使用qPCR檢測相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平，使用免疫組化組織切片觀察UCP1 和 TGR5蛋白，使用Western Blot分析TGR5, D2和UCP1蛋白，使用透射電鏡觀察BAT并計算線粒體的相對數(shù)量，測定線粒體DNA拷貝數(shù)量。最后，研究人員在體內(nèi)試驗和細(xì)胞試驗中分析GE的代謝物和棕色脂肪之間的相關(guān)性。通過對4周齡的C57BL/6Cnc雄性小鼠按劑量2.5g/kg·BW灌胃GE，收集血清后通過UPLC檢測血清中的酚酸類物質(zhì)。通過構(gòu)建棕色脂肪細(xì)胞模型，使用GE的代謝物處理細(xì)胞后，使用qPCR檢測UCP1 和TGR5蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。

1. 在高脂動物模型中GE能夠抵抗肥胖并且提升葡萄糖穩(wěn)態(tài)

從第7周開始，GE作為膳食干預(yù)劑能夠顯著抵抗高脂小鼠由于飼喂高脂飼料引起的體重增加，GE干預(yù)組小鼠體重比HFFD組輕15.12%（圖1A）。體重下降的一部分原因是因為小鼠脂肪組織的減少，包括白色脂肪組織的減少和肝臟重量的降低（圖1B），一部分原因是與脂肪細(xì)胞的減小和肝臟中脂肪含量的減少有關(guān)（圖1C）。然而，三組小鼠的飲食和飲水?dāng)z入量并沒有顯著性差異（圖1D）。在GE的攝入干預(yù)下，小鼠血清中的葡萄糖和膽固醇含量能夠恢復(fù)到正常水平（圖1E）。小鼠在注射葡萄糖后，GE干預(yù)組的小鼠顯示出更強(qiáng)的葡萄糖抵抗能力（圖1F和1G），并且能夠提升胰島素的敏感性（圖1H和1I）。因此，基于上述結(jié)果認(rèn)為GE的攝入能夠抵抗小鼠由于飼喂高脂飼料導(dǎo)致的肥胖，并且能夠提高胰島素的敏感性。

2. GE能夠增強(qiáng)能量代謝和減輕炎癥

由于肥胖和能量消耗密切相關(guān)，因此研究GE在能量代謝方面的作用。發(fā)現(xiàn)HFFD組和GE干預(yù)組的小鼠，在飲食、飲水?dāng)z入量方面不存在顯著性差異（圖2A），在能量攝入量和能量吸收量方面也不存在顯著性差異（圖2B和2C）。GE干預(yù)組的小鼠顯示出更高的氧氣消耗量和二氧化碳釋放量（圖2D-H），而在活動量方面和HFFD組小鼠之間不存在顯著性差異（圖2I）?；谏鲜鼋Y(jié)果，認(rèn)為GE是通過增加能量消耗量來抵抗肥胖。

當(dāng)患有肥胖和二型糖尿病時，機(jī)體的免疫系統(tǒng)會發(fā)生變化，最明顯的變化是在脂肪組織、肝臟和白細(xì)胞中發(fā)生炎癥。因此，研究人員測定了血清、腹部白色脂肪組織和肝臟中的炎癥因子。發(fā)現(xiàn)GE干預(yù)組的血清樣品中，IL-6、TNA-α和LPS的含量下降（圖2J）。發(fā)現(xiàn)GE干預(yù)組腹部白色脂肪組織和肝臟組織的樣品中，IL-6、TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）的轉(zhuǎn)錄水平下降（圖2K和2L）。在GE干預(yù)組的肝臟樣品切片中，發(fā)現(xiàn)攝入GE能夠減少肝臟脂肪的積累和減輕淋巴細(xì)胞的的局灶性浸潤（圖2M）。上述結(jié)果說明GE的膳食干預(yù)能夠減輕由于高脂飼料攝入導(dǎo)致的炎癥。

3. 在高脂飼料飼喂的小鼠中，GE的補(bǔ)充恢復(fù)了腸道微生態(tài)系統(tǒng)的紊亂

通過16S rDNA測序分析盲腸糞便樣品的腸道微生態(tài)系統(tǒng)。圖3A展示的結(jié)果說明測序質(zhì)量是合格的，能夠滿足后續(xù)數(shù)據(jù)分析。HFFD組小鼠的測序結(jié)果顯示在門水平上擬桿菌門和變形桿菌門的相對豐度上升，GE干預(yù)組小鼠中門水平上這兩類菌的相對豐度趨向正常，同時還使疣微菌門的相對豐度上升。GE干預(yù)組小鼠糞便樣品中厚壁菌門/擬桿菌門的比例更高（圖3B和C），而且具有更高的菌群多樣性和豐度（圖3E-H）。根據(jù)主坐標(biāo)分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)GE干預(yù)組的菌群結(jié)構(gòu)更加接近標(biāo)準(zhǔn)飼料組的小鼠菌群結(jié)構(gòu)，和HFFD組小鼠差異明顯。（圖3I-J）。在主成分分析圖中顯示，HFFD組的樣品更加集中，可以認(rèn)為高脂飼料對腸道微生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生一種選擇壓力，促使腸道菌群結(jié)構(gòu)向著一個相同的方向靠近，而GE的干預(yù)減輕了這種選擇壓力（圖3I-J）。根據(jù)LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)在屬水平上Bacteroides和Desulfovibrio是GE干預(yù)組中下降最多的菌屬，這個趨勢和門水平上是一致的（圖3K）?？傮w而言，GE的干預(yù)能夠恢復(fù)由于高脂飼料導(dǎo)致的腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂。

4. GE的補(bǔ)充能夠改變膽汁酸水平，并與腸道微生態(tài)系統(tǒng)具有相關(guān)性

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是影響各種膽汁酸轉(zhuǎn)變的重要因素，而膽汁酸是影響哺乳動物能量代謝的關(guān)鍵因素。本研究想要確定GE干預(yù)后的腸道微生態(tài)系統(tǒng)是否能夠影響小鼠血清中的膽汁酸水平，是否可以影響膽汁酸的代謝？結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂高脂飼料會導(dǎo)致膽汁酸含量的升高，而GE的干預(yù)能夠顯著降低膽汁酸含量，主要影響的是結(jié)合型膽汁酸，例如TαMCA和TβMCA（圖4A）。同時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GE干預(yù)組的小鼠血清中TCA，TUDCA和THDCA的相對含量出現(xiàn)下降，DCA的相對含量卻升高了（圖4B）。GE的干預(yù)導(dǎo)致游離型膽汁酸/結(jié)合型膽汁酸和次級膽汁酸/初級膽汁酸比例的升高，這個結(jié)果說明GE的干預(yù)可以通過腸道微生態(tài)系統(tǒng)促進(jìn)膽汁酸的降解（圖4C）。雖然沒有研究證明Akkermansia菌具有分泌膽鹽水解酶（BSH）的能力，但是從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)Akkermansia菌和膽汁酸之間存在相關(guān)性。運用Spearman相關(guān)性分析分析腸道微生態(tài)系統(tǒng)和膽汁酸之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Akkermansia, Clostridium 和Bifidobacterium的豐度與TαMCA, TβMCA 和TCA的濃度之間存在負(fù)相關(guān)，卻與DCA的濃度之間存在正相關(guān)（圖4D-F）。上述結(jié)果說明Akkermansia, Clostridium 和Bifidobacterium三種菌可能具有降解膽汁酸的能力。因此，研究人員認(rèn)為GE的干預(yù)改變了血清中的膽汁酸組成和含量，而這種改變可能和腸道微生態(tài)系統(tǒng)存在部分的相關(guān)性。

圖4 GE的攝入改變了膽汁酸的含量和組成，并且這種改變與腸道微生態(tài)系統(tǒng)有相關(guān)性。（A和B）血清中膽汁酸的含量和相對含量（n=5）。（C）結(jié)合型膽汁酸和游離型膽汁酸的比例（n=5）。通過Spearman相關(guān)性分析來分析Akkermansia(D)，Clostridium(E)，Bifidobacterium (F)和膽汁酸的相關(guān)性（n=5）。

5. GE的補(bǔ)充通過上調(diào)TGR5來刺激棕色脂肪組織激活產(chǎn)生熱量

上述實驗結(jié)果說明，GE的干預(yù)能夠通過增加能量消耗來抵抗肥胖，同時能夠通過改變腸道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)來改變血清中膽汁酸水平。因為棕色脂肪組織是機(jī)體產(chǎn)生熱量的重要場所，同時能夠調(diào)節(jié)膽汁酸水平?？紤]到棕色脂肪組織的作用，研究人員下一步研究GE是否能夠?qū)ψ厣窘M織產(chǎn)生積極的影響。TGR5是一種膽汁酸的特異性受體，能夠調(diào)通過控制棕色脂肪組織中的下游基因D2來調(diào)控產(chǎn)熱作用相關(guān)基因UCP1和PRDM16。鵝去氧膽酸（CDCA），DCA和石膽酸（LCA）是TGR5的天然刺激劑。實驗發(fā)現(xiàn)GE干預(yù)組小鼠血清中DCA的含量顯著升高（圖4A），TGR5、UCP1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著升高（圖5A-C），同時發(fā)現(xiàn)PRDM16、D2的轉(zhuǎn)錄水平也升高了（圖5A）。上述結(jié)果說明GE的干預(yù)能夠激活TGR5-D2的產(chǎn)熱作用相關(guān)基因。根據(jù)小鼠在4度環(huán)境中的體溫監(jiān)控結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GE的干預(yù)能夠顯著增強(qiáng)產(chǎn)熱作用（圖5D）。通過PET-CT照片的結(jié)果，能夠發(fā)現(xiàn)GE的干預(yù)能夠增加葡萄糖的吸收（圖5E）。

脂肪酸是棕色脂肪組織發(fā)揮產(chǎn)熱作用的最初燃料來源。通過分析基因PGCAα，PGC1β，MCAD，PPARα和ATGL轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)GE的干預(yù)能夠加速脂肪酸的氧化。同時，發(fā)現(xiàn)GE的干預(yù)能夠增加線粒體的相對數(shù)量和線粒體DNA的拷貝數(shù)量，并且上調(diào)線粒體合成基因TAM和NRF2（圖5G-J）?？傮w而言，在高脂小鼠模型中，GE的干預(yù)能夠改變膽汁酸水平，通過影響膽汁酸受體TGR5從而影響了棕色脂肪組織的產(chǎn)熱作用。

6. 在體外試驗中，GE的代謝物不能顯著影響TGR5的轉(zhuǎn)錄水平

根據(jù)已有研究，血清中的小分子酚酸是GE的初級代謝產(chǎn)物。本研究想要確定GE的初級代謝產(chǎn)物-小分子酚酸是否能夠直接激活TGR5？研究人員發(fā)現(xiàn)在補(bǔ)充GE的小鼠血清中GA，PCA，HPA和CA顯著提高（圖6A-E）。然后，研究人員通過小鼠鼠胚胎成纖維細(xì)胞進(jìn)一步分化構(gòu)建了成熟的棕色脂肪細(xì)胞，在該細(xì)胞模型中，使用單一的小分子酚酸或者是上述小分子酚酸的混合物進(jìn)行實驗。結(jié)果表明，GA，CA，VA和小分子酚酸的混合物能夠上調(diào)UCP1基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖6F），但是TGR5基因轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著變化。這說明一定濃度的GE的初級代謝產(chǎn)物-小分子酚酸不能影響TGR5。

本研究旨在研究GE在抵抗肥胖和代謝紊亂方面的積極作用和相應(yīng)機(jī)制。在高脂小鼠模型中，GE的干預(yù)能夠抵抗小鼠體重的增加，減少脂肪的累積，提高胰島素敏感性，并且降低系統(tǒng)性炎癥，這些活性主要是由于GE能夠促進(jìn)能量消耗。同時，GE的干預(yù)能夠部分恢復(fù)由于高脂飼料導(dǎo)致的腸道微生態(tài)系統(tǒng)紊亂，并且顯著增加Bifidobacterium 和Clostridia菌的相對豐度。GE的干預(yù)能夠通過影響腸道微生態(tài)系統(tǒng)間接影響血清中的膽汁酸水平，根據(jù)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium 和Clostridia菌和DCA存在正相關(guān)。而且，膽汁酸的變化能夠刺激棕色脂肪組織激活產(chǎn)熱，DCA具有更顯著的作用效果。研究人員進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，在棕色脂肪細(xì)胞模型中，TGR5的轉(zhuǎn)錄水平并不能被GE的代謝物影響。但是，GE影響腸道微生態(tài)系統(tǒng)和膽汁酸水平的機(jī)制仍然不清楚。本研究為膳食多酚的研究提供了一個新的視角。

本研究使用的GE的劑量能夠為制定人體飲食攝入量提供參考。之前的研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致肥胖的小鼠模型中，補(bǔ)充C3G，蘆丁和VA作為膳食干預(yù)劑能夠抵抗小鼠肥胖。和其他研究進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，在飲水中添加1%C3G能夠降低17.8%的小鼠體重，但是該研究中使用的劑量高于單一多酚的每日推薦攝入量。在本研究中，在飲水中添加1%GE能夠降低15.8%的小鼠體重，GE的使用劑量是405 mg/kg BW，是符合多酚每日推薦攝入量的。

許多研究發(fā)現(xiàn)由于人體對膳食多酚的吸收和利用能力有限，使得多酚類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物難以發(fā)揮作用，膳食多酚卻能夠通過影響腸道微生態(tài)系統(tǒng)從而發(fā)揮抵抗肥胖和緩解炎癥的健康功效。葡萄籽原花青素提取物（GSPE）能夠緩解高脂小鼠模型中小鼠的炎癥和肥胖，但是這些效果在用抗生素處理小鼠后消失了，這個現(xiàn)象證明了GSPE是通過調(diào)節(jié)小鼠的腸道微生態(tài)系統(tǒng)來發(fā)揮抵抗肥胖的健康功效。已有研究報道，卡姆果在Germ-free小鼠模型中通過恢復(fù)小鼠的腸道微生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮抵抗肥胖和調(diào)節(jié)代謝紊亂的功效。已有研究報道，富含多酚的蔓越莓提取物能夠通過增加Akkermansia菌屬的豐度發(fā)揮抵抗肥胖的功效。腸道微生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)態(tài)由機(jī)體的年齡、基因、營養(yǎng)攝入和生活習(xí)慣等多種因素共同調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)GE作為膳食干預(yù)劑能夠?qū)δc道微生態(tài)的穩(wěn)定起到積極的作用。從許多研究中可以發(fā)現(xiàn)攝入GE后能夠升高厚壁菌門與擬桿菌門的比例。從實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，GE的干預(yù)能夠增加小鼠中Bifidobacterium和Clostridium菌屬的豐度，這些菌能夠分泌膽鹽水解酶，從而導(dǎo)致血清中的TαMCA 和TβMCA含量的下降。從結(jié)果中，可以發(fā)現(xiàn)Akkermansia菌與TαMCA 和TβMCA含量存在顯著的負(fù)相關(guān)，但是目前還沒有研究報道該菌具有分泌膽鹽水解酶的能力，而類似的結(jié)果也在蔓越莓提取物抵抗高脂小鼠肥胖的研究中發(fā)現(xiàn)了。已有研究報道，富含多酚的膳食，例如可可、茶和紅酒能夠防止由于高脂飲食導(dǎo)致的肥胖，這些效果的產(chǎn)生與Akkermansia, Bifidobacterium和Lactobacillus這些菌具有相關(guān)性。有研究表明，每日服用紅酒多酚能夠顯著增加人體中Enterococcus, Bacteroides, Bifidobacterium和Bacteroides菌的豐度。有研究表明，在體內(nèi)和體外試驗中，服用氯化錦葵色素和氯化錦葵色素苷類衍生物能夠增加Bifidobacterium菌的豐度。

TGR5是細(xì)胞膜上的膽汁酸受體，在棕色脂肪組織中能夠被次級膽汁酸激活。在棕色脂肪組織中，次級膽汁酸的含量增加，例如DCA, CDCA和LCA，能夠?qū)е?/span>TGR5的激活，并且導(dǎo)致下游基因D2轉(zhuǎn)錄水平的增加，D2基因通過調(diào)控PRDM16和UCP1基因轉(zhuǎn)錄水平升高從而調(diào)控棕色脂肪組織發(fā)生產(chǎn)熱作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GE的補(bǔ)充能夠顯著增加DCA的含量，而DCA能夠通過調(diào)控TGR5-D2-UCP1途徑刺激棕色脂肪組織發(fā)生產(chǎn)熱作用。

葡萄和紅酒中存在的原花青素和花色苷等多種膳食多酚都難以被人體和動物有效利用。本研究在血清中鑒定到多種更簡單的酚類化合物，該結(jié)果說明腸道菌群能夠降解膳食多酚。Jimenez-Giron等人發(fā)現(xiàn)在飲用葡萄汁后，可以從血漿中鑒定到CA，VA，syringic acid (SA), 3,5-dihydroxybenzoic acid (35DHBA), 3-O-methylgallic acid (3OMGA) 和ferulic acid (FA)。Jacobs等人報道人體在飲用紅酒和葡萄多酚提取物后能夠增加14種酚類代謝物。在本研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果，在攝入GE干預(yù)后，GA，PCA，HPA，CA和VA的含量增加了。但是，GA，PCA，HPA，CA和VA等酚類代謝物不能影響TGR5的轉(zhuǎn)錄水平，卻能夠上調(diào)UCP1的轉(zhuǎn)錄水平，這個結(jié)果說明可能存在另一條通路能夠調(diào)控棕色脂肪組織。

但是本研究也存在一些不足之處。首先，只檢測了小鼠的腹部白色脂肪、附睪白色脂肪和肝臟重量，還有很多其他的小鼠體成分沒有檢測。在該動物實驗中，三組小鼠體重沒有顯著性差異，而在這種情況下檢測小鼠的能量代謝更加具有說服力，由于可以排除小鼠體重差異帶來的干擾?？梢栽?/span>Germ-free小鼠模型中驗證GE的功效是否與腸道微生態(tài)系統(tǒng)具有依賴性，而基因敲除動物模型可以用來驗證TGR5在棕色脂肪組織產(chǎn)熱過程中的作用。

通過飲食干預(yù)促進(jìn)人體健康，緩解肥胖等代謝綜合征成為新的趨勢。本文使用富含膳食多酚的葡萄提取物作為膳食干預(yù)劑，從腸道微生態(tài)系統(tǒng)和膽汁酸代謝角度系統(tǒng)性研究了抵抗肥胖的機(jī)制，根據(jù)高脂小鼠的體征變化，分析能量代謝情況，確定起關(guān)鍵作用的菌屬，并進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析膽汁酸與腸道微生態(tài)的相關(guān)性。隨后，以膽汁酸受體TGR5為靶點，從代謝物、轉(zhuǎn)錄和蛋白水平等多角度驗證對棕色脂肪組織激活的影響。本文為揭示膳食營養(yǎng)、腸道微生態(tài)系統(tǒng)與代謝綜合征之間的關(guān)系提供了重要的依據(jù)。

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