【原】科研| Hepatology：糞便微生物組可以區(qū)分酒精性肝炎與飲酒者，但不區(qū)分疾病嚴(yán)重程度

微科享 2021-04-19

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編譯：晨曦，編輯：謝衣、江舜堯。

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導(dǎo)讀

研究背景和目的：腸道微生物群在酒精性肝炎中的作用尚未確定。本研究的目的是：（1）研究酒精性肝炎患者糞便微生物生態(tài)特征；（2）研究微生物變化與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系；（3）推斷微生物生態(tài)變化的功能相關(guān)性。

研究方法：將中、重度酒精性肝炎（MAH、SAH）患者的糞便微生物群與健康人（HC）和重度飲酒對照組（HDC）進(jìn)行比較。16S熱測序鑒定微生物類群。利用PICRUSt進(jìn)行功能基因組學(xué)研究。采用LC/MS平臺檢測糞便短鏈脂肪酸（SCFA）。

分組：78名受試者（HC，n=24；HDC，n=20；MAH，n=10；SAH，n=24）

論文ID

原名：Fecal microbiome distinguishes alcohol consumption from alcoholic hepatitis but does not discriminate disease severity

譯名：糞便微生物組可以區(qū)分酒精性肝炎與飲酒者，但不區(qū)分疾病嚴(yán)重程度

期刊：Hepatology

IF：14.971

發(fā)表時間：2020.2

通訊作者：Arun J. Sanyal M.D.

通訊作者單位：弗吉尼亞州里士滿市弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)內(nèi)科胃腸病學(xué)、肝病學(xué)和營養(yǎng)科

實驗設(shè)計

實驗結(jié)果

1 研究隊列

共78研究對象入組，其中HC（健康）, n=24; HDC（酗酒對照）, n=20; MAH（中度酒精性肝炎）, n=10; SAH（重度酒精性肝炎）, n=24。

飲酒組中男性偏多。健康組比飲酒組年輕。酒精性肝炎患者膽固醇、白蛋白、血小板降低，AST、ALT、膽紅素、白細(xì)胞計數(shù)升高；與酗酒對照組相比，酒精性肝炎患者的INR、MELD、Child-Pugh和DF評分更高；這些疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)在重度酒精性肝炎組中最高。四組患者的心理狀況相似。在重度酒精性肝炎患者中，抑酸藥物（質(zhì)子泵抑制劑或H2受體阻滯劑）的使用率較高（表1），但這個并不影響腸道菌群組成。

表1研究隊列特征特征

2 飲酒引起的糞便微生物組分變化

為了確定飲酒的影響，首先比較酗酒組和健康組的微生物類群。與健康對照組相比，在門水平上，酗酒組富含厚壁菌門（49%比62%，p=0.08），同時擬桿菌門明顯減少（46%比26%，p=0.01，圖1A-B），與健康組相比，酗酒組的厚壁菌門與擬桿菌門的比率（2.39比1.05，p=0.02）高出127%（圖1C-D）。盡管HDC的厚壁菌門/擬桿菌門的比率仍然較高于HC（圖1D），厚壁菌門豐度從HDC-MAH-SAH呈逐步下降趨勢（圖1B和1E-F）。

從HC-HDC-MAH，變形菌門的比例略有增加。然而，與HC和HDC相比，SAH的變形菌門進(jìn)一步顯著增加（圖1A-B和1E-F）。

圖1 四組樣本腸道菌群整體分布

3 酒精性肝炎的發(fā)生與糞便微生物群的明顯變化有關(guān)

在屬水平上，四個組之間的Shannonα-多樣性差異顯著。健康組和酗酒組無顯著差異。中度酒精性肝炎的α-多樣性呈下降趨勢，重度酒精性肝炎進(jìn)一步降低（圖2A）。PCoA主坐標(biāo)分析顯示，四組的細(xì)菌組成有顯著差異（圖2B）。對照組（HC和HDC）與肝炎組（MAH和SAH）在PCoA圖上明顯分離，表明對照組（HC和HDC）與肝炎組（MAH和SAH）的微生物組成相似，但酒精性肝炎與對照組有明顯區(qū)別。因此，酒精性肝炎的發(fā)生與微生物組成的明顯變化有關(guān)，而微生物組成并不僅僅是簡單的飲酒影響。

值得注意的是，在任何一組患者中，微生物組分的變化都是不均勻的。一些重度飲酒對照組（圖2B中標(biāo)記為70、68、39、76、59、43）的微生物群組成與中重度酒精性肝炎組相似。其中兩名患者（標(biāo)記為59和68）的MELD評分分別為10和8。另一方面，本組2例中度酒精性肝炎（60例，34例）和1例重度酒精性肝炎（54例）的微生物組分與重度飲酒對照組的微生物組分密切相關(guān)。這些患者的MELD評分分別為14、19和23分。一位重度酒精性肝炎患者（49個）的微生物群與健康對照組相似，此人的MELD評分為22分。異常值的微生物組成不能用聯(lián)合用藥來解釋。

圖2四組樣本腸道微生物組內(nèi)和組間差異分析

飲酒與酒精性肝炎引起的微生物群差異性改變。基于成對比較的LDA得分>2，在科和屬水平上的特定細(xì)菌的差異富集如柱狀圖（圖3）所示。對于每個對照組，富集分類群用一個水平條表示，其長度與該組富集程度相對應(yīng)。

圖3 特定菌群差異富集

飲酒與特定微生物群的差異富集有關(guān)。為了研究酒精攝入對腸道菌群的影響，將健康對照組的腸道菌群與高酒精攝入組（即HDC、SAH和MAH組）的腸道菌群進(jìn)行比較。酗酒組中富含腸桿菌科、毛螺菌科、乳酸桿菌科和普雷沃氏菌科、糖類桿菌、鏈球菌科和維管菌科，在健康對照組中，酸氨基球菌科、類桿菌科、毛螺菌科家族的一些屬等富含。

酒精性肝炎與糞便微生物組分的明顯變化有關(guān)。為了評估肝炎對那些大量飲酒的人腸道微生物組分的影響，首先酒精性肝炎（MAH和SAH）與酗酒組比對，發(fā)現(xiàn)酒精性肝炎患者中含有豐富的環(huán)孢菌科、梭桿菌科和細(xì)脈菌科的幾個屬。在酗酒組中，富含來自科氏菌科的多個附加分類群，腸球菌科、毛螺菌科和瘤胃球菌科等。接下來比較MAH組與HDC組。在HDC富集科氏菌科和科氏菌科，以及毛螺菌科和瘤胃菌科科的幾個分類群。MAH組中富含克隆菌科、腸球菌科、腸球菌科、消化鏈球菌科和維管菌科。其次，將SAH組與HDC組比較，發(fā)現(xiàn)SAH中富含放線菌科、環(huán)抱菌科、梭桿菌科、發(fā)酵糖桿菌科和細(xì)脈桿菌科，酗酒組中富含梭菌屬、毛螺菌科和瘤胃球菌科。

酒精性肝炎人群中梭桿菌富集。為了進(jìn)一步確定微生物群變化與酒精性肝炎嚴(yán)重程度的關(guān)系，比較了SAH與MAH腸道菌群。SAH中放線菌科和梭桿菌科增加。MAH中富含毛螺菌科和疣微菌科（健康組較肝炎組豐富）以及消化鏈球菌。

酒精性肝炎的微生物組學(xué)特征不同于單純飲酒。為了研究微生物群從酒精性肝炎患者區(qū)分SAH的鑒別能力，比較所有飲酒過量的受試者（即HDC、SAH和MAH）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將酒精性肝炎患者從所有飲酒人中區(qū)分出來。采用K-fold交叉驗證隨機(jī)森林分類模型進(jìn)一步對個體微生物群的判別能力進(jìn)行排序。圖4A左顯示了前20個區(qū)別屬的重度飲酒控制組和酒精性肝炎組的分類群相對豐度。在相對豐度較低的水平上觀察到大多數(shù)有鑒別意義的分類群，而在酒精性肝炎中最豐富的分類群是細(xì)脈線蟲科細(xì)脈線蟲和擬桿菌科擬桿菌，而在酗酒對照中最豐富的分類群則是毛螺菌科毛螺菌。支持信息中提供了分類群屬對模型預(yù)測精度的貢獻(xiàn)排序。因此，酒精性肝炎可與酗酒對照組區(qū)分開來，僅根據(jù)微生物組分的預(yù)測準(zhǔn)確度相對較高（AUC=0.826；圖4B）。

飲酒組的微生物組分與MELD評分相關(guān)。利用MELD評分作為潛在酒精性肝炎的替代指標(biāo)，我們還檢測了所有飲酒組（HDC、MAH、SAH）的微生物組成?；谀c道菌群在屬水平上預(yù)測MELD得分的隨機(jī)森林回歸模型，確定在前20個分類群中，最豐富的屬是鏈球菌科鏈球菌、擬桿菌科擬桿菌屬（圖4A右）。

微生物組分不能區(qū)分中度和重度酒精性肝炎。比對了SAH與MAH進(jìn)一步研究腸道菌群組成是否與酒精性肝炎嚴(yán)重程度相關(guān)。采用兩種建模方法：一種以確定輕中度和重度酒精性肝炎；另一種將MELD評分作為一個關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，腸道微生物組分不足以區(qū)分輕中度酒精性肝炎。且微生物群與MELD評分低關(guān)聯(lián)，表明雖然腸道菌群組成雖然隨酒精性肝炎的發(fā)展而變化，但它不是疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測因子。

圖4酒精性肝炎的發(fā)生與糞便微生物群的明顯變化有關(guān)，而酒精性肝炎嚴(yán)重程度與糞便菌群無關(guān)

4 糞便中短鏈脂肪酸與差異腸道菌群關(guān)系

為了推斷微生物生態(tài)變化與疾病嚴(yán)重程度的功能相關(guān)性，靶向分析糞便中代謝物短鏈脂肪酸（SCFA）以表征糞便微生物群差異的功能。SCFA被選作靶向代謝是因為SCFA與腸上皮屏障的完整性，腸道和全身炎癥反應(yīng)，包括肝臟炎癥和肝代謝相關(guān)；此外，我們的數(shù)據(jù)表明，酒精性肝炎與毛螺菌科和瘤胃菌科家族的顯著減少有關(guān)（圖3，圖5a），這兩個家族是腸道中眾所周知的SCFA產(chǎn)生者。

在MAH患者中，毛螺菌科的7/20個菌屬和瘤胃菌科中的4/18個菌屬減少（圖3，第3欄）。在SAH中，毛螺菌科15/20個菌屬和瘤胃菌科14/18個菌屬減少（圖3第4欄）。與HDC相比，MAH和SAH中毛螺菌科羅斯氏菌屬均顯著減少，而瘤胃菌科糞桿菌屬僅在SAH中減少。

除了毛螺菌科和瘤胃菌科外，與HDC相比，其他已知的產(chǎn)SCFA的菌韋榮球菌科鏈型桿菌屬在SAH中也減少了，但MAH中沒有減少。然而，與HDC相比，已知的SCFA產(chǎn)生菌韋榮球菌科韋榮氏球菌屬巨球型菌屬在MAH和SAH中均富集。

同時，與HDC相比，SAH患者糞便中檢測到的所有SCFA（乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、異丁酸鹽、2-甲基丁酸鹽、異戊酸鹽、戊酸鹽和己酸鹽）均顯著減少（圖5b）。與HDC患者相比，MAH患者的3種糞便代謝物（異丁酸、2-甲基丁酸和異戊酸）明顯減少。然而，MAH和SAH的糞便SCFA濃度沒有顯著差異。

圖5 短鏈脂肪酸與差異腸道菌群關(guān)聯(lián)分析

5 差異腸道微生物與代謝物功能之間的關(guān)系

利用PICRUSt分析宏基因組學(xué)，以預(yù)測與飲酒和酒精性肝炎相關(guān)的腸道基因組功能潛能（圖6）。

代謝途徑的數(shù)量隨著酒精的消耗而減少。與飲酒者（HDC/MAH/SAH）相比，HC組富含多種氨基酸代謝途徑，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基酸相關(guān)酶、精氨酸和脯氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸、組氨酸、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成途徑，后一組患者的色氨酸代謝途徑均較豐富。在碳水化合物代謝途徑中，健康對照組的氨基糖、核苷酸糖、淀粉和蔗糖代謝較豐富，而飲酒組的抗壞血酸、醛酸和丙酸代謝較豐富。HC組鞘脂代謝豐富，飲酒組不飽和脂肪酸和脂肪酸生物合成豐富。HC組中富集多種能量代謝途徑及外源物質(zhì)代謝途徑。

酒精性肝炎的發(fā)展導(dǎo)致了基因組的額外變化。與酒精性肝炎（MAH+SAH）相比，酗酒組精氨酸和脯氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑豐富，而酒精性肝炎患者中富集了色氨酸代謝、酪氨酸和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑。酒精性肝炎患者中維生素c、醛酸和檸檬酸循環(huán)途徑更豐富。酗酒組體內(nèi)富集了多種能量代謝途徑和脂質(zhì)代謝途徑，而酒精性肝炎患者中富集葡聚糖生物合成代謝途徑和外源性代謝途徑。與MAH相比，HDC中外源性生物降解、萜類化合物和聚酮類化合物的代謝和代謝更為豐富。此外，對比HDC與SAH，HDC中精氨酸、脯氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成氨基酸代謝途徑含量豐富，SAH中色氨酸、酪氨酸、纈氨酸亮氨酸和異亮氨酸降解途徑豐富。HDC中脂代謝豐富，SAH中多糖、多糖和外源性代謝途徑豐富。最后，比較MAH與SAH，發(fā)現(xiàn)并無代謝途徑在兩者之間有顯著差異。