本文由Jingzhi Zhang編譯，董小橙、江舜堯編輯。

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原名：Root microbiota drive direct integration of phosphate stress and immunity

譯名：根際微生物驅動磷酸鹽脅迫與免疫的直接整合

期刊：Nature

IF：41.577

發(fā)表時間：2017年

通信作者：Gabriel Castrillo

通信作者單位：美國北卡羅來納大學生物系

本實驗在野外開展，我們在Mason 農場（北卡羅萊納,美國;+ 35°53’ 30.40’’,? 79°1′5.37′′）^[19]收集了沒有被殺蟲劑和肥料污染的的表從土壤（大約20cm），標注為MF。將處理好的土壤裝入（2 ×2 平方英寸）方形罐子中，用來種植作物。土壤微量養(yǎng)分分析參照Lundberg, D.S等^[19]。

本研究中使用的擬南芥突變體均來自哥倫比亞大學(Col-0)。詳見補充表16。所有種子表面用70%漂白劑滅菌8分鐘，0.2%吐溫-20滅菌8分鐘，用無菌蒸餾水沖洗3倍，以消除種子表面的細菌。種子在4°黑暗中分開。為了確定缺磷在控制微生物群落結構中的作用。我們分析了5個與磷—轉運系統(tǒng)相關的突變體(pht1;1, pht1;1 pht1;4, phf1, nla, and pho2)和2個直接參與磷─缺乏感應調控的突變體(phr1和spx1 spx2)。所有這些根系都在根系中表達^[13,18]。

種子在無菌方形花盆中萌發(fā)，花盆中裝滿如上所述的MF土。同時，我們也使用沒有植物的花盆作為“大塊土壤”對照。所有的罐子，包括對照組，都是每周2次用非無菌蒸餾水從頂部澆水，以避免氯和其他自來水添加劑的污染。植物生長在晚上16h，18°，白天8小時21°的生長室中7周。在所有實驗中，根據大氣噪聲產生的真實隨機情況，將含有不同基因型植物的花盆隨機放置在托盤中；我們從www.random.org獲取的這些數據。我們將托盤放置在生長室中，沒有注意到它們所包含的花盆，也沒有注意到花盆的標簽，而是定期對它們進行重新洗牌。

取植物和對照土壤，分離了它們的內生菌室(EC)微生物群落^[19]，DNA提取采用96孔格的Mo Bio Power Soil Kit (MOBIO Laboratories)試劑盒提取，按說明提取。

采用Ames^[25]的方法測定不同磷處理的幼苗幼芽中磷酸鹽的含量。采用Image J軟件^[26]測定主根長伸長，采用Win Rhizo軟件^[27]測定側根面積和根數。

1 植物根系微生物群落對磷酸鹽脅迫的反應

我們通過比較野生型擬南芥Col-0與三種磷脅迫反應（PSR）突變體的根系細菌群落，將PSR與根系微生物組連接起來(圖1a, b，補充文本1;擴展數據圖1;補充表1)。PSR是在無菌苗中開展，并且測定植物莖中的磷濃度，其在這些突變體中是可變的。在富含磷和無菌條件下，phr1植物積累的游離磷比野生型少[13]。pht1;1, pht1;1 pht1;4 and phf1積累非常低的磷水平，并表達PSR^{[14, 15]}，而pho2、nla和spx1 spx2表達不同程度的Pi超積累^{[16 - 18}]。我們在先前描述的野生土壤^[19]中種植物，土壤中沒有明顯的磷酸鹽缺乏(擴展數據圖2)。一般情況下，野生土壤中生長的PSR突變體的Pi濃度與無菌條件下的Pi濃度相同，除了phf1和nla的表型與無菌瓊脂中觀察到的相反，phr1的Pi濃度與Col-0相同(圖1b)。這些結果表明，復雜的化學條件、土壤微生物或這些因素的組合可以改變突變體中的Pi代謝。

根內生細菌與之前的研究結果一致^[2,19]。約束排序法表明，在這些PSR突變體所代表的Pi累積梯度上，細菌群落之間存在顯著差異。[CAP分析，5.3%的約束方差]（圖1c）。CAP分析表明，phr1和spx1 spx2具有不同的群落，這可以從它們在前三個排序軸上的分離得到證明，而Pi-transport突變體對phf1的影響最大(圖1c)。與野生型相比，突變型植物根系內細菌的豐度不同。同一PSR類型的突變體在低分類水平上對根微生物組具有相似的影響[97%同一OTU](圖1d)。而在更高的分類水平上，它們沒有重疊效應(Family, Extended Data Fig. 1g)。這表明親緣關系密切的細菌群體在相同宿主基因型上具有不同的定植模式。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)PSR突變體信號類型可以很好的解釋我們發(fā)現(xiàn)的濃縮和損耗文件，而不是突變體積累Pi的能力：所有的與Pi轉運相關的突變體對根系微生物也有類似的影響，而相對的PSR控制基因phr1 spx1 spx2表現(xiàn)出獨特的模式(圖1 a、d和擴展數據圖1 f,g)。我們的研究結果表明，不同PSR水平會影響野生土壤中植物根系微生物組的組成，導致不同濃度的Pi積累，其中特定微生物的豐度也會發(fā)生變化。

圖 1

2 磷酸鹽脅迫反應的微觀構建

我們在野外土壤中的觀察表明，PSR與微生物群落的存在之間存在復雜的相互作用。因此，我們從十字花科(幾乎全部來自擬南芥)根和兩種野生土壤中分離出35種分類學上不同的基因組測序，建立了一個易于操作但復雜的合成細菌群落(Syn Com)。我們將近似于野生型根內基因Syn Com觀察到門水平分布(擴展數據圖3，補充表1，補充表2)。我們將col0、phf1和雙重突變的phr1 phl1 (phr113的冗余部分)幼苗接種在低或高Pi瓊脂平板上(補充文本2)。12天后，我們注意到Syn Com對低Pi條件下生長的Col-0植株的莖Pi積累有負作用，而對富含磷酸鹽條件下生長的植株沒有負作用(圖2a)。如預期，兩種PSR突變體累積Pi均小于Col-0;Syn Com并沒有修復這個缺陷。因此，在這個微觀世界中，與植物相關的微生物推動了與植物相關的Pi競爭。

我們試圖確定PSR是否被Syn Com激活。我們基于核心文獻集合生成了一個包含193個PSR轉錄標記基因，并對其在轉錄實驗中的表達進行了探究(擴展數據圖4a, b，補充表3)。在無菌低Pi條件下，只有本構型Pi脅迫突變體phf1能夠誘導這些PSR標記物。相比之下，與高Pi條件下生長的植株相比，Col-0植株對PSR標記的誘導能力較差(圖2b)。這可以用蔗糖中關鍵成分vitro20的有意缺少對PSR的反應來解釋，但是并不適用于聯(lián)合使用擴展數據的Syn Com定植的協(xié)議。值得注意的是，Syn Com顯著增強了colo -0中Pi饑餓的典型轉錄反應(圖2b)；這依賴于PHR1和PHL1(圖2b;擴展數據圖4b)。相關對照證實了這些結論(補充案文2;擴展數據圖4，6)。重要的是，用Syn Com在0或50M Pi上預定殖的植物的芽，在沒有額外細菌的情況下，當隨后轉移到完全Pi條件時，累積的Pi是類似處理的非定殖植物的20 - 40倍(圖2c和補充表4 )。這表明Syn Com可以激活PSR的功能。因此，我們認為，由Syn Com誘導的對低Pi的轉錄的反應，反映了復雜生物環(huán)境中正常PSR的一個完整的微生物過程。

我們評估了用Syn Com種植的植物的瓊脂和根相關的微生物群（補充文本3；圖2d，e；擴展數據圖7e，f；補充表5）。與野生土壤中植物生長的結果一致，我們發(fā)現(xiàn)PSR突變體未能組裝野生型Syn Com微生物群（圖2f）。有些菌株在PSR突變體phf1和phr1 phl1（圖2e，f；擴展數據圖7c）、Pi濃度（圖2g；擴展數據圖7d）或樣本分數（擴展數據圖7b，e，f）上差異明顯。這些結果建立了一個研究植物與植物相關微生物長期競爭下PSR的微觀重構系統(tǒng)，并確認了所測試的PSR突變體影響根系部分微生物群落。

圖 2

3 磷酸鹽脅迫反應與免疫系統(tǒng)輸出之間的控制

我們注意到phr1 phl1和phf1在我們的Syn Com存在下差異地激活轉錄PSR（圖2b）。因此，我們研究了Syn Com中植物的轉錄組，以了解這些微生物是如何依賴phr1激活PSR的。我們鑒定了差異表達基因（DEG），這些基因對低Pi、Syn Com的存在或兩者的組合（以下為PSR-Syn Com DEG）作出反應（補充文本4；擴展數據圖8a,b，補充表6）。分層聚類分析(圖3a，補充表7)表明，與phr1或phr1 phl1相比，Col-0中活化更強的基因集(c1、c2、c7和c10)。這些簇包含了大多數由PHR1調控的核心PSR標記(圖3b)。在一項獨立的Ch IP-seq實驗中發(fā)現(xiàn)的PHR1直接靶點(圖3c，補充表8)、PHR1啟動子結合基序(擴展數據圖4c)以及與PSR相關的生物學過程中涉及的基因(圖3d和補充表9)也得到了富集。PHR1在植物免疫轉錄調控中發(fā)揮了重要作用。十二個聚類中的五個（圖3a；c3、c6、c7、c8和c11）富含與植物免疫系統(tǒng)輸出相關的基因；其中四個在茉莉酸（JA）和/或水楊酸（SA）通路標記（圖3d、c3、c7、c8和c11；補充表9）中表現(xiàn)過高，其中三個四為PRO1直接靶向富集（圖3C）。SA和JA是植物免疫激素調節(jié)劑，至少SA調節(jié)擬南芥根部微生物組成^[2]。

為了進一步探索PHR1在植物免疫調節(jié)中的功能，我們在應用茉莉酸甲酯（Me JA）或SA類似物苯并噻二唑（BTH;補充表10）后產生了處理匹配的Col-0幼苗的轉錄組時程數據。我們發(fā)現(xiàn)PSR-Syn Com DEGs中SA和JA激活基因的過量表達（468對比SA預測為251，對JA預測為65對80; p <0.0001，超幾何測試）（擴展數據圖。8c-h，補充表7）。大部分SA響應基因在phr1和phr1 phl1中的表達強于Col-0; 這些經典SA依賴性防御基因強烈富集（擴展數據圖8d，e）。第二組在phr1和phr1 phl1中表達較col0少的sa反應基因缺乏經典的sa依賴性防御基因，且對可能參與PSR的基因富集較弱(擴展數據圖8d)。相比之下，大多數JA響應基因在phr1和phr1 phl1中表現(xiàn)出較低的表達（擴展數據圖8g，h），包括已知或預測介導防御相關硫代葡萄糖苷生物合成的46個基因中的18個子集（擴展數據圖。8I）^[21]。這與最近的觀察結果一致，即phr1在Pi脅迫期間表現(xiàn)出降低的硫代葡萄糖苷水平^[22]。SA-和JA-上調基因的分析顯示，直接的PHR1靶點富集(圖3e)，與此相反，一些直接靶點富集的PHR1調控簇也富集了防御基因(圖3c, d)。許多SA-和JA-應答基因是PSR-Syn Com DEGs（圖3f;擴展數據圖8c-h，補充表7）。因此，PHR1在我們的Syn Com觸發(fā)PSR期間，直接調控植物免疫系統(tǒng)中一個意想不到的比例。

圖 3

4 PHR1整合植物免疫系統(tǒng)輸出和磷酸鹽應激反應

我們測試了PHR1是否也在通常用于研究PSR的條件下控制植物防御基因的表達。我們在這些條件下對低Pi進行RNA-seq，在col0中識別出1482 DEGs，在phr1 phl1中識別出1161 DEGs(圖4a, b;圖9，補充表11)。我們的大量BTH / SA激活基因在phr1 phl1中也被上調，但在低Pi中也沒有在Col-0中上調（圖4a，b;補充表12）。這些與我們的Sym Com在phr1 phl1誘導的防御基因大量重疊（圖4c;紅色橢圓，113/337 = 33％;來自圖3a的簇c3和c8）。至少14/113是直接PHR1目標（補充表12）。

為了證實PHR1在調控微生物反應中的作用，我們分析了暴露于鞭毛蛋白肽flg22的Col-0和phr1 phl1植物的轉錄譜。我們選擇長期暴露于flg22以模擬與微生物組接觸的植物的狀況。我們發(fā)現(xiàn)phr1 phl1植物顯示出比Col-0更高的flg22應答基因^[23]的表達，而這與磷酸鹽狀態(tài)無關（補充文本5;圖4d;擴展數據圖9a，b;補充表11;補充表13）。這說明PHR1負調控由flg22引起的免疫應答。

我們假設phr1 phl1對病原體感染的反應會發(fā)生改變。phr1和phr1 phl1突變體對擬南芥分離透明單胞菌Noco2和丁香假單胞菌桿菌DC3000均表現(xiàn)出較強的抗病性(圖4e, f)。因此，這些結果證實了PHR1直接調控PSR和植物免疫系統(tǒng)。

圖 4

植物對磷酸鹽脅迫的反應與富含微生物的土壤中的生命息息相關。我們證實了控制PSR的基因有助于正常根系微生物組的形成。令人驚訝的是，我們的Syn Com在有限磷酸鹽培養(yǎng)的植物中增強了PHR1（PSR的主要調節(jié)因子）的活性。這導致我們發(fā)現(xiàn)PHR1是功能相關的植物免疫系統(tǒng)基因組的直接調節(jié)劑。盡管在PSR需要激活JA反應基因^[24]，我們發(fā)現(xiàn)PHR1不太可能是這種反應的一般調節(jié)因子（擴展數據圖9c-e，補充表12），而是可以微調特定生物背景下的JA反應。

我們證明PHR1（可能還有PHL1）直接調控PSR和免疫系統(tǒng)輸出。我們提供了一個大體的解釋，這與以前研究不同，即PSR和防御系統(tǒng)是協(xié)調的，并暗示PHR1是關鍵的調節(jié)器[8,11,12,24]。我們提供了植物營養(yǎng)應激反應、免疫系統(tǒng)功能和微生物群落組成和維護的交互的新見解;以及在自然和農業(yè)環(huán)境中同時和協(xié)調行動的系統(tǒng)。我們的研究結果將推動利用微生物提高磷酸鹽使用效率的方面。