背景

基因編輯“大咖“張鋒博士領銜的團隊，最大的貢獻之一是研究發(fā)現(xiàn)CRISPR_Cas9可以在gRNA引導下特異性切割DNA，實現(xiàn)基因編輯功能。并于2020年3月4日，張鋒領銜的基因組編輯公司Editas Medicine和全球領先的制藥公司艾爾建（Allergan）宣布使用CRISPR基因編輯療法進行世界首例患者體內(nèi)給藥。

然而近期，張鋒團隊又發(fā)現(xiàn)CRISRP系統(tǒng)除了可以進行高效地基因編輯（主要是Cas9酶）之外，還可以進行基因檢測（Cas13,Cas12a,Csm6），相關文章已經(jīng)發(fā)表在Nature和Science。這里先介紹一下浙大團隊和復旦團隊一起合作開發(fā)的Cas12a基因檢測系統(tǒng)。

Cas酶介紹

CRISPR_Cas核酸酶主要包括兩類：一類是RNA引導下可以切割RNA鏈的Cas13a和Cas13b；另一類是RNA引導下可以切割DNA鏈的Cas12a和Cas14。Cas12a和Cas13都有一個共同特點，除了切割靶向DNA或RNA序列之外，還可以切割其他DNA或RNA序列，但是Cas13酶的這種附加切割能力比Cas12a要強。

Cas12a的靶基因是ssDNA和dsDNA，并且Cas12a引導鏈需要識別PAM序列（Cas12a的PAM序列為TTTV）。

圖1.Cas12a和Cas13比較

Cas12a介紹

Cas12a酶的附加DNA酶切功能，可以切割特定單鏈DNA探針（熒光和淬滅標記），實現(xiàn)核酸檢測。RPA擴增的雙鏈DNA，在crRNA的引導下Cas12a可以切割雙鏈模板DNA和熒光標記探針，探針被水解后釋放出熒光信號，通過檢測熒光信號便可知道是否有DNA模板。

圖2.Cas12a附加DNA酶切功能

CRISPR-Cas12a快速核酸檢測系統(tǒng)

浙大和復旦團隊將RAP擴增技術和Cas12a的這種所謂的“脫靶作用”，進行結合實現(xiàn)了基因快速檢測。首先進行RPA快速等溫擴增，擴增過程只需要15min，并且在擴增反應管中，除了包括RPA擴增的所有體系之外，也包括除Cas12a酶之外酶切的所有體系，他們是將Cas12a酶固定在擴增反應管壁上。

RPA擴增15min后，通過離心作用，Cas12a酶與反應液混合，再反應15min。因RPA擴增產(chǎn)物量較多，反應結束后可在藍光（440-485nm）下肉眼觀察到熒光。研究者將這種檢測方法稱為Cas12aVDt（Cas12a-based Visual Detection），也就是Cas12a依賴的可視化檢測。

圖3.Cas12aVDet原理圖

此外，研究者發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)檢測下線可以達到10aM。

圖4.Cas12aVDet系統(tǒng)檢測下線可達10aM

整個檢測過程中RPA擴增的反應體系和Cas12a酶切的體系是混合在一起的，為了能讓Cas12a有效地切割RPA擴增產(chǎn)物，作者通過大量實驗摸索發(fā)現(xiàn)用NEB buffer 2.1有較好的酶切效果。而為什么在RPA擴增過程中沒有將Cas12a一起加進反應體系，主要也是因為Cas12a可以切割雙鏈DNA。如果在RPA擴增過程中加進Cas12a，將不會有大量的產(chǎn)物產(chǎn)生，也不會大量的熒光信號。

結論

Cas12aVDet系統(tǒng)整個檢測時間只需要30min，實現(xiàn)了快速檢測。通過藍光檢測肉眼觀察是否有PCR信號，實現(xiàn)了即時檢測。檢測下線可以達到10aM，實現(xiàn)了高靈敏度檢測。所以Cas12aVDet是一種快速，靈敏和簡單的DNA檢測技術。

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