大家好，今天小編要和大家分享的是今年5月份發(fā)表在Theranostics(IF：8.579)上的一篇文章，“Macrophage correlates with immunophenotype and predicts anti-PD-L1 response of urothelial cancer”，作者通過構建IBCs治療的LASSO Cox預后回歸模型發(fā)現(xiàn)了M1的預后價值，將其與常用的指標相比較并通過富集分析得出可能的內(nèi)在原因，同時也發(fā)現(xiàn)了M1與mUC患者的免疫表型相關，讓我們花幾分鐘時間來學習一下這篇文章吧！

巨噬細胞與免疫表型相關并預測尿路上皮癌的抗PD-L1反應

一. 文章背景

免疫檢查點阻斷療法(Immune-checkpoint blockades,ICBs)已經(jīng)日常被用于治療轉移的尿路上皮癌(metastatic urothelial cancer，mUC)，但是ICBs療法只在一部分mUC患者中起到療效以及持久作用，因此急需發(fā)現(xiàn)穩(wěn)健的分子標志物。作者基于348例預處理的mUC樣本，尋找潛在可能的分子標志物

二.文章思路

• 文章論證M1可以作為uMC患者IBCs治療效果的標志分子的整體邏輯思路
  

• 作者特征選擇以及LASSO Cox回歸模型構建時的細節(jié)：

三.結果解讀

樣本數(shù)據(jù)來源

• 本文訓練數(shù)據(jù)來自18年的一篇叫TGF-b attenuates tumor response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells的文章，樣本數(shù)據(jù)為348名接受過PD-L1抑制劑(Atezolizumab)治療的mUC患者的轉錄組數(shù)據(jù)。我們可以從這個網(wǎng)址下載(http://research-pub./IMvigor210CoreBiologies/)本文的數(shù)據(jù)，作者已經(jīng)封裝到了"IMvigor210CoreBiologies"包中

• 本文利用TCGA-BLCA隊列對其研究結果進行驗證。用TCGAbiolinks包下載了TCGA數(shù)據(jù)庫中TCGA-BLCA轉錄組數(shù)據(jù)以及臨床信息

• 所有的RNA-seq數(shù)據(jù)都被轉換為TPM單位后進行特征基因得分的計算

1.mUC隊列的LASSO Cox回歸模型以及風險評分模型的構建

1. 作者從GO、KEGG、REACTOME、HALLMARK獲取了所有的功能、通路特征基因集，加上與腫瘤微環(huán)境、腫瘤固有通路、代謝相關的特征基因集(從其他文獻中收集)以及從CIBERSORT，TIMER，EPIC，xCell，MCP-counter，ESTIMATE中獲得的免疫細胞特征基因集，一共7556個特征用于構建LASSO模型

2. 接著針對每個樣本進行特征基因分數(shù)(signature gene score)的計算，作者采用PCA算法(計算前對特征中的基因進行Z分數(shù)標準化)，取PC1作為樣本在該特征基因集中的得分

3. 下一步進行特征選擇(Feature Engineering)，所有的7556個特征的得分先在全樣本范圍內(nèi)標準化后根據(jù)以下標準篩選特征

• 與樣本預后相關的，Mantel-Cox檢驗，p<0.01

• 與治療效果有關，指標為CR/PR(完全緩解/部分緩解)，SD/PD(疾病穩(wěn)定/疾病進展)，p<0.05

4. 經(jīng)上一步篩選后得到了780個特征在348個樣本中構建LASSO Cox回歸模型。LASSO模型構建時按六四開把樣本分為訓練集和驗證集，采用10折交叉驗證，懲罰項選用lambda.min

5. 之后用得到的各特征的回歸系數(shù)構建風險得分公式，計算樣本的risk score，并用survminer包中的方法(文中出現(xiàn)的cut-pff都由此法算出)確定cut-off把樣本分為高/低風險組

大致過程已在論證思路的第二幅圖中給出

2.M1型巨噬細胞有望預測PD-L1阻斷治療療效

• A-B：左右分別是訓練集和驗證集中的風險預測模型結果以及樣本的特征基因分數(shù)，所使用的回歸系數(shù)以及風險得分的cut-off值都由訓練集得到。由最下方熱圖可以看出M1型巨噬細胞特征基因在低風險組中是高表達的，暗示其可能為IBCs療效的指標

• C-D：分別在訓練集和驗證集中就高低風險組進行生存分析，高低風險組在預后水平上有顯著差異，風險得分與mUC患者預后顯著相關

• E-F：在訓練集和驗證集中用ROC曲線檢驗了風險預測模型的預測能力
  

• G：利用自主抽樣法(Bootstrap sampling)獲取穩(wěn)定的預測特征，即每次從訓練集中抽取80%的樣本，根據(jù)上一步得到的780個特征構建LASSO回歸模型，重復一萬次。統(tǒng)計每個特征出現(xiàn)的頻率，以此來選出最穩(wěn)定的可以預測預后的特征，也就是圖中看到的M1型巨噬細胞

• H：樣本根據(jù)M1型巨噬細胞特征基因得分分為高低表達組，生存分析表明該特征有預后價值

上述結果說明了作者構建的風險預測模型的預測能力，并發(fā)現(xiàn)低風險組地表達M1型巨噬細胞以及M1特征基因有預后價值，加上自主抽樣法的結果，作者認為M1型巨噬細胞有能力預測IBCs的療效并作為其穩(wěn)定指標

圖2. M1型巨噬細胞有預測IBCs預后能力

3.M1型巨噬細胞的預測能力比CD8+T細胞和PD-L1表達量好但差于TMB和TNB

現(xiàn)有的預測抗PD-L1治療效果的組織標志分子一般為TMB(腫瘤突變負荷)、TNB(腫瘤新生抗原負荷)、T細胞浸潤情況、PD-L1的表達量等。下面作者將M1型巨噬細胞的預測能力與這幾類指標比較，進一步說明M1型巨噬細胞是IBCs的一個穩(wěn)定的預測指標

• A-C：圖AB分別是樣本M1型巨噬細胞特征值和TMB、TNB的相關性分析，都呈顯著的中等相關。圖C是M1與IBCs臨床療效的相關性，在完全康復CR的患者中，M1型巨噬細胞特征值要顯著高于其他三者

• A-C+D：由圖D中的AUC可以看出M1型巨噬細胞的預測療效的能力并不比TMB、TNB好，但是將M1與兩者結合則可以提高預測能力。圖A-C可以發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞在預測患者預后結果上要比TMB、TNB要表現(xiàn)得稍好些

• E：聯(lián)合M1和TMB可以更好地預測患者預后

• F：M1型巨噬細胞的預測療效的能力要比CD8+T細胞、GEP和PD-L1表達量好

圖4.M1與其他指標在療效和預后預測力上的比較

• G-J：在四類不同的接受過免疫治療的癌癥樣本中，M1型巨噬細胞特征基因同樣可以預測療效，但并沒有好于CD8+T細胞和T細胞基因表達譜(GEP)。四種不同類型癌癥樣本來源標注在圖上方

公共數(shù)據(jù)庫驗證隊列的信息

• 接受過PD-L1治療的mUC患者，轉移黑色素瘤樣本，接受MAGE-3治療的非小細胞癌樣本，接受多種免疫療法的晚期黑色素瘤樣本，TCGA-SKCM中接受過抗CTLA-4治療的小鼠，接受過抗PD-1治療的轉移胃癌患者。所有這些樣本的轉錄組數(shù)據(jù)用于確定M1型巨噬細胞的預后預測能力

• K-L：TC和IC分別是IBCs治療后免疫組化得到的腫瘤細胞和免疫細胞的PD-L1表達等級，PD-L1表達量高者，其M1型巨噬細胞浸潤程度也越大

• M+S2EF：盡管之前有研究發(fā)現(xiàn)mUC患者的分子亞型對其治療和預后有影響，但在作者的研究中，分子亞型與mUC患者的M1水平僅有微弱相關或兩者關系沒有統(tǒng)計學意義

• S2G：利用多因素COX回歸分析發(fā)現(xiàn)M1巨噬細胞的浸潤水平是一個獨立的預后因子

• N：作者還發(fā)現(xiàn)mUC患者的M1型巨噬細胞浸潤水平有識別樣本腫瘤中免疫細胞的耗竭情況的可能

圖5.不同癌癥背景下M1同樣有預測能力

4.M1型巨噬細胞與免疫表型和TME景觀相關

• A-C：作者基于樣本的TME(腫瘤微環(huán)境)細胞組成對樣本進行一致性聚類(consensus clustering)，得到簇A和簇B。此處TME的細胞組成是根據(jù)CIBERSORT算法，用LM22基因特征推斷得出。可以看到熱圖中，簇A樣本的M1型巨噬細胞以及另一些細胞的浸潤程度大。圖C生存曲線看出簇A的預后要顯著好于簇B

圖9.M1浸潤程度與不同的轉錄、代謝特征相關

6. 腫瘤本身的基因組改變與高M1巨噬細胞譜有關

• A-C：在TP53、FBXW7發(fā)生突變了的樣本中，其M1浸潤程度要顯著高于野生組；而在FGFR3發(fā)生了突變的樣本中，其M1浸潤程度要顯著低于野生組，值得注意的是FGFR3突變已被認為是ICBs抵抗的標志分子

• D-F：FGFR突變的樣本中，免疫表型更多為耗竭型(D)，伴隨著低于野生組的免疫評分和較高的腫瘤純度評分(EF)，且低表達免疫檢查點通路，高表達耐藥代謝通路(G)

作者同樣以TCGA-BLCA隊列作為驗證集，做相同分析得到了相似的結果，驗證了結果的可靠性