目前，糖尿病患病情況形勢嚴峻，調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國20～79歲人群中糖尿病患病人數(shù)約占全球糖尿病患者總數(shù)的1/4，居世界第1位，且世界衛(wèi)生組織預(yù)測至2025年全球糖尿病患者總數(shù)將突破3億^[2]。西醫(yī)認為糖尿病主要病變在于胰島素分泌缺陷、胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂，進而導(dǎo)致大血管和微血管并發(fā)癥。中醫(yī)認為糖尿病歸屬“消渴病”范疇，其基本病機為陰虛燥熱，氣血津液失調(diào)；臨床多以氣陰兩虛為主^[3]。目前臨床對2型糖尿病患者，多采取口服降糖藥物、皮下注射胰島素等方式，然而患者的血糖控制達標率不足1/3^[4]。中醫(yī)藥注重整體辨治，未病先防，其合理開發(fā)應(yīng)用對2型糖尿病的防治有著非常重要的臨床意義。

參芪降糖顆粒是由山東魯南制藥股份有限公司研制，由人參（莖葉）皂苷、黃芪、五味子、山藥、地黃、覆盆子、麥冬、茯苓、天花粉、澤瀉、枸杞子11味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、滋脾補腎的功效，主治消渴癥。臨床上主要用于治療氣陰兩虛、脾腎不足型糖尿病及其并發(fā)癥患者，效果良好，與西藥聯(lián)合使用可增加臨床療效，減少不良反應(yīng)發(fā)生^[5]。

目前，針對參芪降糖顆粒的研究無論是臨床觀察還是實驗研究，都未能精準明確地指出該藥物的有效活性成分、體內(nèi)作用靶點和作用機制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用計算機科學(xué)、分子生物學(xué)和藥學(xué)等學(xué)科的成果，可以從整體上對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用的現(xiàn)代內(nèi)涵進行多層次的解析^[6]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測參芪降糖顆粒治療2型糖尿病的潛在作用靶點和作用機制，為糖尿病的臨床干預(yù)治療提供新的思路。

1  材料與方法

1.1  參芪降糖顆?；钚猿煞趾Y選

利用數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://ibts./LSP/tcmsp.php）^[7]、TCMID（http://www.megabionet. org/tcmid/）^[8]結(jié)合文獻挖掘的方法收集參芪降糖顆粒11味藥的主要化學(xué)成分。根據(jù)成分的毒藥物動力學(xué)（ADME）參數(shù)進行篩選，其中篩選條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18^[9]。針對篩選出的參芪降糖顆?；钚猿煞郑?/span>（https://pubchem.ncbi.nlm./search/）^[10]搜索各成分簡化分子線性輸入規(guī)范SMILES（Simplified molecular input lineentry specification）。

1.2  活性成分潛在靶點反向預(yù)測

Swiss TargetPrediction（http://www./）^[11]服務(wù)器是一個基于反向分子對接技術(shù)能精確預(yù)測生物活性分子靶點的服務(wù)器，它是根據(jù)已知配體的2D和3D相似性聯(lián)合檢測而進行的預(yù)測，且能在5種不同的生物中進行相應(yīng)預(yù)測。首先登陸該服務(wù)器，選擇物種“Homosapiens”，然后輸入“1.1”項中搜索到的smiles式，提交，得到所選成分潛在靶點的預(yù)測結(jié)果。

1.3  2型糖尿病靶點預(yù)測

是一個自動集成來自125個網(wǎng)絡(luò)源的以基因為中心的，包括基因組、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組、遺傳、臨床和功能信息可搜索、綜合的數(shù)據(jù)庫。登錄GeneCards，輸入關(guān)鍵詞“Type 2 diabetes”“T2DM”“Diabetesmellitus type 2”，得到與2型糖尿病相關(guān)的基因，以相關(guān)性分數(shù)（Relevance score）≥30作為篩選條件，篩選結(jié)果作為疾病的候選靶點基因。

1.4  網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過活性成分、反向靶點預(yù)測結(jié)果得到成分-org/）^[13]軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)；利用韋恩圖（Venn diagram）得到成分靶點與疾病靶點的交集，即潛在靶點，導(dǎo)入STRING（Search Tool for the Retrieval ofInteracting Genes/Proteins，Version：10.5，http:///），1個用于搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)^[14]。選用Multiple proteins工具，限定物種為“人”，獲取蛋白相互作用，并保存其TSV格式文件。將文件中的node1、node2和combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件繪制蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以節(jié)點度（degree）值反映靶點大小和顏色，從而構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

將成分-靶點網(wǎng)絡(luò)與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行merge，最終得到疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

網(wǎng)絡(luò)圖中代表化學(xué)成分、靶點、疾病的點稱為節(jié)點。并運用Cytoscape 3.5.1中的插件Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)degree，篩選出degree高于平均值的節(jié)點進一步構(gòu)建疾病-成分-靶點核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5  網(wǎng)絡(luò)分析

是一個全面的基因富集分析網(wǎng)站，共包含來自102個基因集庫的180 184個帶注釋的基因集，通過Enrichr在線網(wǎng)站對篩選得到的參芪降糖顆粒干預(yù)2型糖尿病潛在的核心靶點基因進行結(jié)合基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。依據(jù)combined score值，選取排名前15項目，利用image GP工具（http://www. ehbio.com/ImageGP/）依次繪制參芪降糖顆粒治療2型糖尿病涉及的細胞組分（cellular component，CC）分析、分子功能（molecular function，MF）分析、生物學(xué)進程（biologicalprocess，BP）分析和KEGG通路富集分析的氣泡圖。

2  結(jié)果

2.1  活性成分篩選

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫（截止時間2019年1月30日）查詢，查找出各個中藥含有的化學(xué)成分分別為黃芪87個、北五味130個、山藥71個、生地黃49個、覆盆子110個、麥冬56個、茯苓34個、天花粉15個、澤瀉46個、枸杞子188個，經(jīng)OB（≥30%）、DL（≥0.18）篩選后，參芪降糖顆粒一共有活性成分87個，見表1。研究表明人參莖葉皂苷具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、保肝護心、提高免疫、促進細胞增殖、緩解疲勞、降低血清脂質(zhì)含量、抑制血清丙二醛（MDA）升高以及很好的抗氧化作用^[16-18]，在參芪降糖顆粒中，原藥材未用人參而直接選用人參莖葉皂苷，雖然其OB、DL值不符，但考慮其藥理作用，結(jié)合相關(guān)文獻報道和數(shù)據(jù)庫，共篩選出人參莖葉皂苷中12種入血原型成分，分別為人參皂苷Rg₁、Rg₃、Rg₂、Rb₁、Rb₂、Rh₁、Rh₂、Rc、Rf、Re、F₂和擬人參皂苷F₁₁。

其他中藥所含活性成分依次為黃芪10個、北五味8個、山藥8個、生地黃1個、覆盆子2個、茯苓11個、天花粉2個、澤瀉5個、枸杞子20個，另外槲皮素（quercetin）是黃芪、枸杞子、覆盆子的共同化學(xué)成分，山柰酚（kampferol）是黃芪、覆盆子的共同化學(xué)成分，常春藤皂苷元（hederagenin）是黃芪、茯苓的共同化學(xué)成分，β-谷甾醇（β-sitosterol）是生地黃、麥冬、覆盆子的共同化學(xué)成分，谷甾醇（sitosterol）是枸杞子、覆盆子、澤

2.2  化學(xué)成分靶點預(yù)測

通過SwissTargetPrediction服務(wù)器虛擬篩選，共得到成分靶點基因292個，均為UniProt統(tǒng)一命名。

2.3  疾病靶點預(yù)測

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索2型糖尿病，共得到10 321個與2型糖尿病相關(guān)的基因，經(jīng)篩選最終得到546個基因作為疾病候選靶點基因。

2.4  網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.4.1  成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建  將得到的成分-靶點關(guān)系以Excel格式導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件中，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)節(jié)點、邊等基本屬性，得到成分-靶點網(wǎng)絡(luò)如圖1所示。該網(wǎng)絡(luò)共包含379個節(jié)點，1 314條邊，其中87個節(jié)點代表活性成分，292個節(jié)點代表與活性成分相關(guān)的靶點基因，1種成分對應(yīng)多個靶點，120

2.4.2  PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用韋恩圖得到成分和疾病共有潛在靶點66個，導(dǎo)入STRING獲得蛋白相互作用，保存其為TSV格式文件。將文件中的node1、node2和combined score信息導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析，以combined score值反映邊的粗細，以節(jié)點degree值反映靶點大小和顏色，從而構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。該網(wǎng)絡(luò)共有66個節(jié)點和540條邊，網(wǎng)絡(luò)平均鄰居節(jié)點數(shù)為16.364。

2.4.3  疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)  利用Cytoscape 3.5.1中的merge功能將成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)合并，得到的疾病-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)為兩個網(wǎng)絡(luò)的重疊部分，如圖3。網(wǎng)絡(luò)中共有153個節(jié)點和948條邊，其中87個節(jié)點代表參芪降糖顆粒中的活性成分，成分節(jié)點平均度為4.69，大于平均節(jié)點度的成分有43個成分；66個節(jié)點代表參芪降糖顆粒干預(yù)2型糖尿病的潛在靶點，其節(jié)點平均度為22.55，大于平均節(jié)點度的靶點有30個。

2.4.4 

2.5  網(wǎng)絡(luò)分析

將30個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Enrichr數(shù)據(jù)庫，以P＜0.05為篩選條件，GO分析得到CC條目56個、MF條目99個和BP條目763個。其中CC分析可知靶點基因涉及軸突軸膜（傳導(dǎo)神經(jīng)沖動）、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物（參與免疫細胞活化、淋巴細胞發(fā)育）、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、核常染色質(zhì)、血小板α顆粒（參與血小板活化、血栓形成）等；MF分析可知富集基因主要集中在MAP激酶活性、血管內(nèi)皮生長因子受體結(jié)合、磷脂酰肌醇雙磷酸激酶活性、激素受體結(jié)合、載脂蛋白受體結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等功能上；BP分析可知富集基因主要與血管生成、血管平滑肌細胞增殖、泡沫細胞分化、去乙酰酶活性調(diào)控、內(nèi)皮細胞趨化性調(diào)控、干擾素-γ介導(dǎo)的信號通路以及白細胞介素-21的細胞反應(yīng)等密切相關(guān)。KEGG結(jié)果分析共富集105條信號通路，主要與癌癥通路、松弛素信號通路、催乳激素信號通路、IL-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號通路、VEGF信號通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、線粒體自噬、促性腺激素信號通路、c型凝集素受體信號通路等信號通路有著密切聯(lián)系，見圖5。

3  討論

針對糖代謝、脂代謝異常疾病，郭姣等^[19]基于中醫(yī)理論綜合認識糖脂代謝紊亂性疾病，提出糖脂代謝病創(chuàng)新理論。糖脂代謝病是以糖、脂代謝紊亂為特征，由遺傳、環(huán)境、精神等多種因素參與的疾病，以神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥、腸道菌群失調(diào)為核心病理，以高血糖、血脂失調(diào)、非酒精性脂肪肝、超重、高血壓和動脈粥樣硬化等單一或合并出現(xiàn)為主要臨床表現(xiàn)特點。臨床實踐表明中醫(yī)藥用于治療糖脂代謝病有較好的療效，不良反應(yīng)低，宜于長期用藥，標本兼治。

參芪降糖顆粒廣泛應(yīng)用于2型糖尿病及其并發(fā)癥治療，不僅可以減弱胰島素抵抗，增強胰島素敏感，恢復(fù)和保護胰島β細胞功能，而且可以降低三酰甘油，改善糖脂代謝^[20-22]；降低急性時相血清淀粉樣蛋白A（ASAA）水平，調(diào)節(jié)細胞因子與炎癥因子^[23-24]；降低心率，改善心功能，改善神經(jīng)傳導(dǎo)功能和認知功能等^[25-26]。研究中發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因功能都與糖脂代謝病核心病理密切相關(guān)，參芪降糖顆?？赡芡ㄟ^作用于神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、炎癥等相關(guān)的蛋白靶標和通路，起到治療2型糖尿病的作用。

3.1  參芪降糖顆粒通過“多成分-多靶點-多通路”治療2型糖尿病

參芪降糖顆粒治療2型糖尿病的核心網(wǎng)絡(luò)如圖4顯示，參芪降糖顆粒治療2型糖尿病的核心成分有43種，核心靶點有30個，表明參芪降糖顆粒治

3.2  參芪降糖顆粒可通過調(diào)節(jié)“神經(jīng)內(nèi)分泌”改善糖尿病

本研究中發(fā)現(xiàn)，與神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)的靶點有AR、ESR1、MAPT、CYP19A1、NR3C1、REN。AR、ESR1、NR3C1分別為雄激素受體、雌激素受體α和糖皮質(zhì)激素受體；雌激素對新陳代謝、動態(tài)平衡和心血管系統(tǒng)具有保護作用，芳香化酶基因（CYP19A1）在雌激素生物合成中起著重要作用，且在脂肪組織的前脂肪細胞中表達^[27]。糖皮質(zhì)激素可以通過抑制胰島素信號通路來降低胰島素的敏感性^[28]；MAPT在細胞過程的延伸和髓鞘形成中起著至關(guān)重要的作用，其改變可導(dǎo)致神經(jīng)元功能紊亂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性^[29]；腎素可在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的作用下形成血管緊張素II（Ang II）而發(fā)揮收縮血管和刺激醛固酮分泌的生理效應(yīng)，且高糖

3.3  參芪降糖顆?？勺饔糜谝葝u素抵抗相關(guān)靶點和通路

與胰島素抵抗相關(guān)的靶點有PTPN1、NR1H2、PPARG、HMGCR。PTPN1編碼蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B（PTP1B），PTP1B通過對胰島素受體激酶（IRK）或IRK活性片段的磷酸化酪氨酸殘基去磷酸化作用對胰島素信號傳導(dǎo)進行負調(diào)節(jié)^[31]。NR1H2基因可能通過改變胰腺β細胞功能影響2型糖尿病的發(fā)病^[32]。脂代謝紊亂是胰島素抵抗的最早表現(xiàn)和重要特征，PPARG屬于核受體過氧化物酶體增殖激活受體（PPAR）亞家族，PPARγ可調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂代謝和脂肪細胞功能，胰島素增敏劑羅格列酮主要的降糖靶標就是PPARγ^[33-34]；胡巢鳳等^[35]研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉皂苷可能通過增加肝組織氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）mRNA表達而降低血脂水平，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。HMGCR是膽固醇合成的限速酶，HMG-CoA還原生成甲羥戊酸是整個膽固醇合成過程中的限速步驟，該反應(yīng)主要由HMGCR催化^[36]。

3.4  參芪降糖顆?？烧{(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥靶點

與氧化應(yīng)激相關(guān)的靶點有HIF1A和BCL2L1，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）是參與細胞缺氧應(yīng)答基因的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子^[37]，BCL2L1屬于Bcl-2蛋白家族，且已被證實調(diào)節(jié)外線粒體膜通道（VDAC）的開放。VDAC調(diào)節(jié)線粒體膜電位，從而控制線粒體活性氧的產(chǎn)生和細胞色素C的釋放，是細胞凋亡的有力誘導(dǎo)劑^[38]。有研究證明高血糖會損害線粒體代謝，減少葡萄糖引起的ATP增加，進而影響胰島素分泌，進一步升高血糖形成惡性循環(huán)^[39]。

與炎癥相關(guān)的靶點有PTGS2、STAT1、STAT3、EGFR、MAPK14等。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（PTGS）又叫環(huán)氧合酶（COX），PTGS2為“炎癥反應(yīng)基因”^[40]。STAT1、STAT3均是STAT蛋白家族的成員，通過磷酸化可作用于多種細胞因子和生長因子，包括干擾素、EGF、IL-5、IL-6、HGF等，從而促進內(nèi)皮細胞的遷移和血管的形成，有利于血管新生^[41]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK14）是4個p38 MAPKs之一，由p38 MAPKs調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄級聯(lián)會導(dǎo)致IL-β和TNF-α等促炎細胞因子的產(chǎn)生，并導(dǎo)致與炎癥反應(yīng)相關(guān)重要酶的激活^[42]。

3.5  參芪降糖顆粒防治糖尿病可能與其調(diào)控血管增生機制有關(guān)

除上述研究與糖脂代謝病創(chuàng)新理論密切相關(guān)外，本研究還發(fā)現(xiàn)參芪降糖顆?？捎绊懷芤蜃悠鸬街委?/span>2型糖尿病的作用。MAPK通路和VEGF信號通路相互協(xié)調(diào)、相互影響。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）與其受體KDR結(jié)合后，激活MAPK1/8或c-Jun氨基末端激酶（JNK）等，從而影響MAPK信號通路；MAPK是成纖維細胞生長因子2（FGF2）誘導(dǎo)血管生成的調(diào)節(jié)因子，FGF2對內(nèi)皮細胞有趨化和促進有絲分裂作用，促進血管形成，導(dǎo)致血管增生的發(fā)生^[43]。槲皮素能增加MAPK的表達促進MAPK磷酸化，從而發(fā)揮胰島素抵抗作用^[44]。MMP1、MMP2、MMP3、MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族，可以通過加強動脈粥樣硬化

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對參芪降糖顆粒治療2型糖尿病的主要成分和潛在靶點進行研究，最終發(fā)現(xiàn)43種關(guān)鍵活性成分，30個治療2型糖尿病的潛在靶點：MAPT、AR、ESR1、CYP19A1、NR3C1、PTPN1、NR1H2、PPARG、HMGCR、HIF1A、BCL2L1、MAPK14、EGFR、STAT1、STAT3等，表明參芪降糖顆粒治療2型糖尿病是通過多成分、多靶點共同作用結(jié)果，中醫(yī)藥對于復(fù)雜疾病的治療具有極大潛在研究價值。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)性思想對中醫(yī)藥的研究符合中醫(yī)對疾病本質(zhì)的認識，即多種成分協(xié)同作用于多個靶點，調(diào)節(jié)多種生物過程和功能，進而發(fā)揮整體的治療機制^[46-47]。然而，因數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)不完全，獲取的作用靶標不精確等局限性，尚不能完全反映整體狀況，且預(yù)測出的很多新靶點也有待進一步的實驗驗證。

參考文獻（略） 

來  源： 張  晶，李冰冰，黃敏儀，譚麗萍，肖  雪，張貴民，郭  姣． 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的參芪降糖顆粒治療2型糖尿病機制探討 [J]. 中草藥, 2020, 51(19):4861-4883.