文章來(lái)源：中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2017,33(03): 185-189

作者：隆敏 鄭宏庭 

糖尿病各種慢性并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的主要原因，其具體發(fā)生機(jī)制多未闡明，故缺乏有效的干預(yù)措施。近年研究證實(shí)，氧化應(yīng)激(oxidative stress)與糖尿病及其并發(fā)癥有著密切聯(lián)系^[1]。本課題組主要從事糖尿病并發(fā)癥/合并癥發(fā)生機(jī)制與防治策略研究，尤其關(guān)注于核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2)通路在其中的作用，首次發(fā)現(xiàn)NRF2在糖尿病腎病、糖尿病潰瘍、糖尿病肌萎縮等并發(fā)癥中所起的保護(hù)性角色，并提出NRF2靶向糖尿病微血管病變防治新策略。本文就近年來(lái)本領(lǐng)域相關(guān)研究結(jié)果總結(jié)如下。

一、氧化應(yīng)激與NRF2的調(diào)控

氧化應(yīng)激是指在遭受各種有害刺激情況下，機(jī)體內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生與抗氧化防御之間嚴(yán)重失衡，繼而導(dǎo)致組織損傷的過(guò)程。NRF2作為一種在氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)組織損傷中氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，于1996年由Kan克隆得到，是帽和領(lǐng)(cap'n’collar, CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，含6個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，分別為Neh 1～Neh 6。NRF2廣泛表達(dá)于全身各個(gè)組織器官，Zhang等首次完整地證實(shí)了其負(fù)性調(diào)控機(jī)制—— Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Kelch liked ECH-associated protein 1, Keap1)介導(dǎo)的泛素化降解，奠基了NRF2通路的調(diào)控理論，稱之為NRF2信號(hào)的經(jīng)典激活途徑。Keap1包括3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：N端BTB域、連接區(qū)域、C端Kelch域，1999年由Yamamoto克隆得到。正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中的NRF2通過(guò)Neh2結(jié)構(gòu)域與Keap1結(jié)合成二聚體形式，誘導(dǎo)NRF2泛素化降解，導(dǎo)致胞漿及進(jìn)入胞核內(nèi)的NRF2處于低水平狀態(tài)，進(jìn)而保持NRF2下游基因處于基礎(chǔ)表達(dá)水平，細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)。當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激分子或親核物質(zhì)刺激時(shí)，Keap1中的半胱氨酸殘基(C151、C273、C288)構(gòu)象發(fā)生改變，NRF2與Keap1解離，游離的NRF2由胞漿入核，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element, ARE)相互作用，調(diào)節(jié)其下游數(shù)十種抗氧化酶及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，中和過(guò)多活性氧簇，維持細(xì)胞氧化還原平衡，發(fā)揮重要的細(xì)胞保護(hù)功能。具體來(lái)講，NRF2下游基因主要包括三類：(1)抗氧化蛋白：谷胱甘肽過(guò)氧化酶、血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、谷胺酸半胱氨酸連接酶等，具有保持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平的功能；(2)Ⅱ相解毒酶：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸：醌氧化還原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: quinone oxidoreductase，NQO)1等，主要參與分解有毒物質(zhì)，促進(jìn)有毒物質(zhì)代謝與消除；(3)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：多藥耐藥相關(guān)蛋白，參與調(diào)控內(nèi)源性物質(zhì)與外源性物質(zhì)輸出和攝取。綜上，NRF2通過(guò)調(diào)控其下游基因表達(dá)，在抗氧化應(yīng)激及抗炎中發(fā)揮樞紐作用，是迄今為止最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路之一。

二、NRF2通路與糖尿病

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、炎癥、急性肺損傷、肝肺纖維化以及糖尿病等疾病的發(fā)病機(jī)制中均存在氧化應(yīng)激損傷的因素。新近，幾個(gè)國(guó)內(nèi)外課題組更是將糖尿病及其發(fā)病機(jī)制聚焦于氧化應(yīng)激，并揭示了兩者的密切關(guān)聯(lián)，開(kāi)啟了糖尿病研究的新方向^[7,8,9]。正常狀態(tài)下活性氧簇生成與消除維持著動(dòng)態(tài)平衡，與之不同的是，糖尿病患者機(jī)體活性氧簇生成明顯增多，誘發(fā)強(qiáng)烈氧化應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)際上，近些年本課題組的一系列研究不斷證實(shí)了NRF2通路在糖尿病慢性并發(fā)癥，包括糖尿病腎病、糖尿病潰瘍及糖尿病肌萎縮中的保護(hù)作用^{[10,11,12,13]}。課題組發(fā)現(xiàn)無(wú)論是離體研究中采用高糖模擬糖尿病高糖狀態(tài)干預(yù)的靶細(xì)胞，或是在體糖尿病動(dòng)物模型，亦或糖尿病患者組織中活性氧簇水平均明顯升高，NRF2通路激活。分析認(rèn)為NRF2通路激活極有可能是機(jī)體的自我防御保護(hù)性機(jī)制，然而，由于這種代償性保護(hù)作用不足以抵消原發(fā)不利因素導(dǎo)致的損傷，最終表現(xiàn)出靶組織或細(xì)胞受損。

1．NRF2與胰島β細(xì)胞及胰島素抵抗：

基礎(chǔ)條件下，胰島β細(xì)胞自身抗氧化酶水平極低，高濃度活性氧簇可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙，抑制胰島素分泌^[14]；激活NRF2能夠抑制胞內(nèi)活性氧簇蓄積，減輕細(xì)胞凋亡，減弱對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷，恢復(fù)胰島素分泌功能；而NRF2缺失則可惡化胰島β細(xì)胞受損程度^[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)采用NRF2激動(dòng)劑——萊菔硫烷(sulforaphane, SF)預(yù)處理胰腺β-細(xì)胞，可顯著減弱白細(xì)胞介素-1β與干擾素-γ所致細(xì)胞損傷；在體實(shí)驗(yàn)中，利用SF預(yù)處理同樣能夠減輕鏈脲佐菌素(STZ)所致的小鼠胰島破壞，恢復(fù)大部分胰島細(xì)胞功能，使胰島素分泌水平恢復(fù)；深入機(jī)制研究揭示NRF2激動(dòng)劑能夠通過(guò)增加NRF2蛋白水平與上調(diào)其下游基因表達(dá)，抑制NF-кB信號(hào)途徑，減少氧化應(yīng)激所致β細(xì)胞損傷^[16]。此外，一系列研究已經(jīng)證實(shí)：在糖尿病早期，NRF2通過(guò)鈍化高葡萄糖觸發(fā)活性氧簇信號(hào)通路，代償性地使得葡萄糖刺激胰島素分泌增加，甚至恢復(fù)至正常水平；在糖尿病晚期，NRF2則可誘導(dǎo)抗氧化酶表達(dá)，保護(hù)β細(xì)胞免受進(jìn)一步氧化損害，最大限度地減少其對(duì)胰島細(xì)胞分泌功能的影響^[17]。

另一方面，NRF2亦參與胰島素抵抗的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，激活NRF2可明顯減少丙酮醛所致Hep G2肝細(xì)胞的胰島素抵抗^[18]；NRF2激動(dòng)劑還可激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制p70S6激酶的活化、增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4表達(dá)，進(jìn)而抑制高脂小鼠胰島素抵抗的產(chǎn)生，增加胰島素敏感性^[19]；此外，NRF2激活還可通過(guò)抑制白色脂肪組織內(nèi)巨噬細(xì)胞滲入和增加脂聯(lián)素生成，減少肝臟炎癥和NF-кB活性，抑制脂肪、肝臟、全身炎癥，從而減輕肥胖所致胰島素抵抗作用^[20]。

2．NRF2與糖尿病微血管并發(fā)癥：

糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病是最常見(jiàn)的糖尿病微血管病變，雖然發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但研究發(fā)現(xiàn)其與氧化應(yīng)激損傷存在密切聯(lián)系。與NRF2野生型糖尿病鼠相比，NRF2基因敲除型糖尿病鼠視網(wǎng)膜血管滲透性顯著增加、活性氧簇水平較高、谷胱甘肽水平低下、早發(fā)血-視網(wǎng)膜屏障功能障礙且視覺(jué)功能障礙較重^[21]。本課題組關(guān)于NRF2通路與糖尿病的研究，最早開(kāi)始于發(fā)現(xiàn)NRF2對(duì)糖尿病腎病的保護(hù)作用：初步觀察發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者腎小球球部的NRF2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并分析可能與高糖所致的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)^[10]；動(dòng)物研究揭示，NRF2基因敲除糖尿病小鼠腎臟組織的氧化應(yīng)激水平和腎臟受損程度顯著高于NRF2野生型糖尿病鼠；進(jìn)一步離體研究也發(fā)現(xiàn)高糖導(dǎo)致人腎臟系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧簇，并激活NRF2及其下游基因的表達(dá)，提示高糖所致的球部氧化應(yīng)激損傷反饋性激活了NRF2通路^[10]。采用經(jīng)典NRF2激動(dòng)劑SF及肉桂醛(cinnamaldehyde, CA)干預(yù)糖尿病腎病，發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠模型體內(nèi)進(jìn)一步激活NRF2通路可減弱糖尿病常見(jiàn)的糖代謝紊亂癥候群并顯著改善腎小球球部病變，而該作用僅限于NRF2野生型鼠，表明其功能通過(guò)特異的NRF2通路激活^[13]。在此基礎(chǔ)上，課題組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在狼瘡腎炎動(dòng)物模型中，NRF2基因敲除鼠腎臟中的炎性因子NF-κB與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、纖連蛋白、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)均有更高水平的表達(dá)，伴隨更為嚴(yán)重的腎臟病理學(xué)改變；并且在腎小球系膜細(xì)胞中，致腎炎單克隆抗體R4A的效應(yīng)同樣經(jīng)由NF-κB通路，上調(diào)TGF-β1、纖連蛋白的表達(dá)與iNOS的水平；通過(guò)siRNA抑制NRF2，顯著加重了R4A的效應(yīng)，提示NRF2與炎性通路NF-κB之間存在對(duì)話(cross-talk)，NRF2在腎臟通過(guò)負(fù)性調(diào)控NF-κB，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，從而緩解腎臟病變^[22]。本課題組的上述一系列研究預(yù)示著NRF2有望成為糖尿病腎病新的干預(yù)靶標(biāo)，被墨爾本貝克心臟與糖尿病研究中心de Haan教授^[23]撰寫專家述評(píng)，認(rèn)為NRF2通路激動(dòng)劑將成為極具前景的糖尿病腎病治療新靶點(diǎn)。

3．NRF2與糖尿病大血管并發(fā)癥：

NRF2在糖尿病大血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要的保護(hù)作用。一項(xiàng)采用低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, Ldlr)敲除動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與接受NRF2野生型骨髓細(xì)胞移植的Ldlr小鼠相比，接受NRF2敲除型骨髓細(xì)胞移植的Ldlr小鼠動(dòng)脈損傷面積更大，巨噬細(xì)胞凋亡、遷移更為明顯，炎癥反應(yīng)和促炎癥基因表達(dá)增加，提示NRF2缺失可能惡化糖尿病伴隨的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展^[24]。一方面，激活高糖干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)NRF2通路，可減少血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，減輕糖尿病大鼠頸動(dòng)脈粥樣硬化性模型中新生內(nèi)膜增生^[25]。此外，通過(guò)NRF2-siRNA或Keap1過(guò)表達(dá)方式抑制冠脈內(nèi)皮細(xì)胞NRF2通路可導(dǎo)致參與血管生成細(xì)胞的增殖和黏附功能受損，細(xì)胞遷移及形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)能力降低，提示NRF2在血管新生過(guò)程中發(fā)揮重要作用^[26]。

4．NRF2與糖尿病潰瘍：

進(jìn)一步研究揭示NRF2參與糖尿病潰瘍創(chuàng)口愈合。通過(guò)對(duì)糖尿病潰瘍患者臨床樣本的收集分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者皮膚潰瘍周圍組織較非糖尿病外傷患者創(chuàng)口周圍皮膚組織遭受更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，局部細(xì)胞凋亡更嚴(yán)重，NRF2介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)也更明顯^[11]。離體研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境使得人永生化角質(zhì)化細(xì)胞Hacat內(nèi)活性氧簇堆積，伴隨NRF2與Ⅱ相解毒酶上調(diào)，這與既往在糖尿病腎病病變中的初期發(fā)現(xiàn)相似^[10,11]。進(jìn)一步研究證實(shí)活性氧簇堆積抑制Hacat細(xì)胞的增殖/遷移、以及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)上調(diào)，NRF2-siRNA干擾后，細(xì)胞增殖/遷移能力進(jìn)一步下降，而SF與CA可一定程度逆轉(zhuǎn)上述改變。與Werner S研究小組報(bào)道一致，本課題組也觀察到NRF2基因敲除小鼠創(chuàng)口愈合與NRF2野生型小鼠并無(wú)顯著差別^[27]。但本課題組還發(fā)現(xiàn)使用STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型后，NRF2基因敲除糖尿病小鼠創(chuàng)口愈合明顯延遲于NRF2野生型糖尿病小鼠^[11]。結(jié)合此前相關(guān)的一系列研究，提示基礎(chǔ)狀態(tài)下NRF2基因敲除小鼠與NRF2野生型小鼠表型差異并不明顯，只有在一定誘發(fā)條件下，這種差異才得以突顯出來(lái)。推測(cè)這種現(xiàn)象的本質(zhì)歸因于NRF2作為機(jī)體的一種自我保護(hù)性抗氧化機(jī)制，基礎(chǔ)條件下處于非激活低水平狀態(tài)，只有在應(yīng)激情況下才顯示出其強(qiáng)大代償和自我調(diào)控能力，從而減弱機(jī)體氧化應(yīng)激受損程度，這種有趣的特質(zhì)也是NRF2不同于其他常見(jiàn)分子最重要的特點(diǎn)之一。隨后研究也進(jìn)一步證實(shí)了上述分析：相比于野生型小鼠，NRF2基因敲除糖尿病小鼠不僅創(chuàng)口愈合明顯延遲，而且創(chuàng)口處皮膚組織氧化應(yīng)激損傷更重且凋亡明顯；NRF2誘導(dǎo)劑激活NRF2信號(hào)通路明顯促進(jìn)NRF2野生型糖尿病小鼠創(chuàng)口愈合；體外研究發(fā)現(xiàn)NRF2可通過(guò)調(diào)節(jié)高糖導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、人表皮細(xì)胞增殖及遷移能力、細(xì)胞凋亡、改善細(xì)胞外基質(zhì)水平等從而促進(jìn)創(chuàng)口愈合^[11]。

5．NRF2與糖尿病肌萎縮：

另外，NRF2還參與糖尿病肌萎縮與骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)相較于STZ誘導(dǎo)的NRF2野生型糖尿病小鼠，NRF2基因敲除糖尿病小鼠快肌纖維大小、Ⅱ型肌纖維肌球蛋白、肌球蛋白異構(gòu)體與線粒體亞基發(fā)生顯著改變，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1α，PGC-1α)在NRF2基因敲除糖尿病小鼠比目魚肌中的表達(dá)均顯著降低，提示NRF2參與糖尿病肌萎縮與骨骼肌細(xì)胞分化可能與PGC-1α相關(guān)。體外研究表明，采用NRF2-siRNA可導(dǎo)致小鼠成肌細(xì)胞C2C12變異明顯加重，PGC-1α降低；而使用NRF2激動(dòng)劑SF，則可以明顯抑制肌細(xì)胞C2C12的變異，PGC-1α增加，表明NRF2在骨骼肌細(xì)胞分化過(guò)程中扮演著重要的角色，并參與調(diào)控了糖尿病肌萎縮模型中骨骼肌收縮與代謝特性的分子改變^[12]。

三、NRF2激動(dòng)劑臨床應(yīng)用前景與展望

本領(lǐng)域前期研究結(jié)果極大地推進(jìn)了應(yīng)用抗氧化劑防治糖尿病慢性并發(fā)癥的可能性。事實(shí)上，全球首個(gè)使用治療糖尿病腎病的NRF2激動(dòng)劑(bardoxolone methyl)在其Ⅱ期臨床試驗(yàn)中顯示出良好的臨床治療效果^[28]，遺憾的是在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，由于干預(yù)組嚴(yán)重心血管事件發(fā)生明顯高于對(duì)照組而被迫終止^[29]，值得欣慰的是，隨后的基礎(chǔ)研究證實(shí)非高度特異性及劑量依賴性生物學(xué)效應(yīng)可能是導(dǎo)致該種NRF2激動(dòng)劑出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的重要原因^[30,31,32]?？傊?，這些研究提示NRF2激動(dòng)劑用于臨床糖尿病慢性并發(fā)癥的治療還需要進(jìn)一步深入探索。另一方面，一項(xiàng)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)目前臨床常用抗糖尿病藥物，如二肽基肽酶4抑制劑、α-硫辛酸等具有顯著的激活NRF2效應(yīng)^[33]，且具有良好的安全性。因此，進(jìn)一步揭示氧化應(yīng)激尤其是NRF2通路在糖尿病慢性并發(fā)癥中的作用，尋找安全有效且靶向性更強(qiáng)的NRF2激動(dòng)劑用于糖尿病慢性并發(fā)癥的防治，并闡明其保護(hù)機(jī)制具有重要意義和廣闊的臨床應(yīng)用前景。

一個(gè)棘手的問(wèn)題是：雖然NRF2通路進(jìn)一步激活有利于改善糖尿病及其并發(fā)癥預(yù)后，甚至有可能應(yīng)用到臨床相關(guān)疾病的治療中。然而，最新一項(xiàng)研究突破性發(fā)現(xiàn)了NRF2通路激活明顯促進(jìn)已有腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移^[33]。事實(shí)上，NRF2在腫瘤中的'雙重角色'已被不少研究所證實(shí)^[4,5]，這無(wú)疑將對(duì)NRF2激動(dòng)劑應(yīng)用于糖尿病臨床治療，尤其是糖尿病合并腫瘤患者治療提出一個(gè)不可規(guī)避的難題，同時(shí)也警示在進(jìn)行科學(xué)研究并將所得結(jié)果應(yīng)用于臨床前必須反復(fù)權(quán)衡、客觀分析，最終才能使得糖尿病患者能夠真正地從本研究中得以獲益。當(dāng)然，目前證據(jù)顯示未合并腫瘤卻長(zhǎng)期遭受慢性并發(fā)癥折磨的糖尿病患者極有可能從NRF2激動(dòng)劑應(yīng)用中獲益?？陀^來(lái)講，NRF2通路在其他尚未闡釋的糖尿病慢性并發(fā)癥中是否同樣具有保護(hù)作用，亦或扮演類似于腫瘤中的'雙重角色'有待未來(lái)深入研究。