城市和工業(yè)的不斷發(fā)展，需要越來(lái)越多的化學(xué)物質(zhì)，隨之而來(lái)的則是日益增多的化學(xué)污染物。其中鹵代酚類（halogenated phenols，HPs）和硝基酚類化合物（nitrophenols，NPs）在家庭和工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，而這兩類化合物的泄露和農(nóng)藥、除草劑的降解導(dǎo)致它們?cè)诃h(huán)境中不斷富集，這被認(rèn)為會(huì)對(duì)自然環(huán)境和人類健康帶來(lái)極大的危害。生物催化劑作為一種強(qiáng)有力、可持續(xù)且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的催化劑，或許是化解這些污染危機(jī)的有效解決手段。

基于此，泰國(guó)Vidyasirimedhi科學(xué)技術(shù)研究所的Pimchai Chaiyen課題組開發(fā)了一種基于黃素依賴的單加氧酶（Flavin-dependent monooxygenase，HadA）的生物催化體系（Figure 1），可以將HPs和NPs轉(zhuǎn)化為苯醌（benzoquinone，BQ），而苯醌可以和D-半胱氨酸（D-cysteine，D-Cys）反應(yīng)生成D-螢光素（D-luciferin），后者可以作為螢光素酶的底物發(fā)出螢光，實(shí)現(xiàn)相關(guān)污染物的快速簡(jiǎn)便定量/性檢測(cè)，相關(guān)研究成果發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.201904923）。

作者首先檢查了HadA催化一系列苯酚衍生物（4-硝基苯酚（4-NP）、4-氟苯酚（4-FP）、4-氯苯酚（4-CP）、4-溴苯酚（4-BrP）和4-碘酚（4-IP））生成BQ的效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HadA可以在3個(gè)小時(shí)內(nèi)將所有原料全部轉(zhuǎn)化為BQ（轉(zhuǎn)化率100%）。當(dāng)反應(yīng)液中存在D-Cys時(shí)，作者用質(zhì)譜和核磁氫譜證明可以生成D-螢光素。當(dāng)作者往反應(yīng)液中加入螢光素酶后，溶液會(huì)發(fā)出黃綠色的光，其生物發(fā)光的峰值在560nm左右，由于L-螢光素不是螢光素酶的底物，因此證明了生成的產(chǎn)物確實(shí)為D-螢光素。作者還用質(zhì)譜檢測(cè)到了D-螢光素合成的中間產(chǎn)物（Figure 2，table 1）。

（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了提高D-螢光素的產(chǎn)率，作者對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了一系列優(yōu)化（Table 1）：1）調(diào)整反應(yīng)體系濃度：結(jié)果顯示最佳濃度為D-Cys：4-NP=10/1，當(dāng)NAD⁺、FAD、HadA的濃度依次為10、4、50 μM時(shí)，產(chǎn)率可達(dá)4.6%。2）增加BQ的穩(wěn)定性：加入過(guò)氧化氫酶或超氧化物歧化酶等ROS清除劑可以清除反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，從而增加BQ穩(wěn)定性，此時(shí)最高的產(chǎn)率可達(dá)15.8%。3）調(diào)節(jié)溶液pH：在pH等于8的時(shí)候產(chǎn)率可達(dá)21%，是傳統(tǒng)BQ與D-Cys縮合反應(yīng)產(chǎn)率的70倍。同時(shí)作者還研究了加入其他試劑對(duì)生物法發(fā)光信號(hào)的影響，最終發(fā)現(xiàn)加入0.05 mM 輔酶A、4 mM DTT、0.5%（v/v）甘油、62 μM EDTA后可以使熒光信號(hào)增加2倍。作者還發(fā)現(xiàn)生物發(fā)光的信號(hào)在ppb的濃度范圍內(nèi)與濃度成線性相關(guān)，這剛好是美國(guó)環(huán)境保護(hù)署等部門要求檢測(cè)的范圍，因此這種方法可以用于檢測(cè)環(huán)境和食物中的4-NP/HPs。

（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

由于NP、HP是硝基酚類化合物和鹵代酚類化合物在體內(nèi)的主要代謝物，因此常作為尿液和血液中的生物標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)接觸這些物質(zhì)的健康風(fēng)險(xiǎn)，但是傳統(tǒng)依賴質(zhì)譜的方法都需要預(yù)先純化以及高超的操作技術(shù)，這在一定程度上阻礙了對(duì)這些化合物的及時(shí)檢測(cè)。為此，作者嘗試了他們開發(fā)的方法是否可以用生物發(fā)光來(lái)檢測(cè)相關(guān)物質(zhì)（Figure 2, Table 1）。作者在血液和合成尿液樣品中加入了4-NP和4-CP來(lái)模擬含有這些物質(zhì)的樣品，然后用他們開發(fā)的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)他們開發(fā)的方法的檢測(cè)極限和定量極限如下：4-NP和4-CP的定量極限分別為0.1和0.4 ppb，4-NP和4-CP的檢測(cè)極限分別為0.04和0.1 ppb。因此這種方法的檢測(cè)能力符合美國(guó)環(huán)境保護(hù)署等部門的檢測(cè)要求，同時(shí)這種方法還不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何純化處理。

（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

總結(jié)，作者開發(fā)了一種化學(xué)-酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，可以將4-NPs及4-HPs轉(zhuǎn)化為BQ，最終合成D-螢光素。作者通過(guò)一系列條件篩選出了最佳的反應(yīng)條件，可以高效率地合成D-螢光素，同時(shí)可以在螢光素酶的作用下產(chǎn)生螢光。基于這種方法，作者可以直接對(duì)生物樣品中的相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行純化，也無(wú)需高超的操作技巧。因此這是一種使用方便、價(jià)格低廉的化學(xué)污染物檢測(cè)方法，可以用于防止食品和消費(fèi)品污染。