利用重組DNA技術(shù)獲取的生物藥物在人類文明史上具有劃時代的意義。許多價值高產(chǎn)量低的功能蛋白如干擾素、白細胞介素、集落刺激因子、生長激素、胰島素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中獲得了高效率表達。由于工程菌高密度培養(yǎng)能夠提高單位體積的產(chǎn)量，在工業(yè)生產(chǎn)上可以提高效率降低成本。所以，高密度培養(yǎng)一直都是發(fā)酵工程師們所追捧的熱點。本文就工程大腸桿菌高密度發(fā)酵工藝開發(fā)中涉及的關(guān)鍵控制點加以探討。

穩(wěn)定可靠的菌種是工業(yè)化大生產(chǎn)的有力保障，直接關(guān)系到生產(chǎn)效率和成本高低。不同于傳統(tǒng)誘變育種模式，在對待工程菌菌種問題上，有人認為基因工程菌種構(gòu)建完成后無需經(jīng)過嚴格單克隆篩選，既節(jié)約時間成本又大大減少了工作量，這其實是一個認識誤區(qū)。這樣做出來的菌種很難連續(xù)穩(wěn)定傳代50次以上，給中試放大以及后續(xù)的長期穩(wěn)定生產(chǎn)留下了隱患。業(yè)內(nèi)一般以能否穩(wěn)定遺傳50代作為判斷工程菌種優(yōu)劣的一個標準。

發(fā)酵所需的接種量不是越大越好，要適當。接種量過小導(dǎo)致適應(yīng)期過長，菌種易提前老化，也增加了雜菌污染的風險。接種量過大會過早引起溶氧不足，導(dǎo)致發(fā)酵失控。且營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快也會影響后期正常生長。一般大腸桿菌接種量遵循逐級增大的原則，并將最后一級的放大倍數(shù)控制在10倍左右。

種子培養(yǎng)一定要在最佳條件下進行，培養(yǎng)時間不宜過長，當種子生長至最佳狀態(tài)時果斷移種。如果種子做的不好，其負面影響往往在發(fā)酵中后期會有所體現(xiàn)。工程菌種培養(yǎng)會加入抗生素，不僅是為了抑制雜菌生長，更重要的是為了給菌種形成正向的抗性篩選壓力，及時淘汰質(zhì)粒丟失的菌株或者衰老的菌體，保證質(zhì)粒攜帶菌群的正常生長與表達。

除了必須的碳源以外，有機復(fù)合氮源在蛋白表達階段不可或缺。有機復(fù)合氮源可提供豐富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、維生素、生物素以及一些生物活性物質(zhì)，能減輕細胞代謝負擔，促進外源蛋白表達。如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加時，存在一種非常有趣的代謝機制：當流加培養(yǎng)基中只有酵母膏時，重組蛋白不穩(wěn)定；而當流加培養(yǎng)基中只有蛋白胨時，大腸桿菌難以再利用其所產(chǎn)生的乙酸。若將酵母膏和蛋白胨同時加入流加培養(yǎng)基中，不但所生產(chǎn)的重組蛋白非常穩(wěn)定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸。

無機氮源的選擇：(NH4)₂HPO₄為無機氮源時，(NH₄)₂HPO₄自身含有的元素P可促進菌體生長。以(NH₄₎₂SO₄作為無機氮源時，S元素也可促進菌體生長。而硝酸鹽中的N原子不能被菌體直接利用，需要將其N原子還原成NH₄ 才能利用，在這一過程需要消耗一定的能量，因此菌體的生長受到了一定的限制，所以使用NaNO₃或NH₄NO₃作為無機氮源時獲得的菌體量相對較少，不易實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。

高密度發(fā)酵中，微量元素的作用也是不容忽視的，某種微量元素的缺失可能造成菌體量的大幅減少甚至生長受阻。此外，如果所用的菌種在構(gòu)建時進行了必要的基因敲除，有些物質(zhì)（一般是維生素或氨基酸）無法自身合成，如生物素、硫胺素等就必須輔助性添加。

無機鹽組分不僅用于維持細胞滲透壓或發(fā)酵環(huán)境pH穩(wěn)定，其本身往往也參與到細胞代謝之中，如鎂離子是許多酶活性的中心，用法用量需要反復(fù)優(yōu)化。

此外，泡敵是對菌體生長明確有毒害作用的成分，在不影響消泡效果的前提下，有必要摸索其用量的下限作為使用濃度，以減少對菌體的損傷，尤其在種子培養(yǎng)階段。

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發(fā)酵工藝：溶氧（DO）對微生物發(fā)酵的影響及其控制

溶氧（DO）是需氧微生物生長所必需，在發(fā)酵過程中受很多方面因素的影響。28℃時氧在發(fā)酵液中的飽和濃度只有7mg/L，比糖的溶解度小7000倍。高密度發(fā)酵中，菌體代謝強度大，溶氧需求量極高，對設(shè)備供氧能力要求也相應(yīng)較高，DO往往成為生長代謝限制因素。為避免DO失控，DO設(shè)定值通常會處于較低的水平。由于DO電極校準時存在偏差或者電極老化檢測數(shù)據(jù)本身就不準確，很可能導(dǎo)致罐內(nèi)缺氧時未被發(fā)及時發(fā)現(xiàn)。判斷發(fā)酵過程是否受氧的限制，最簡單的辦法是把培養(yǎng)溫度降低2~4度（不影響發(fā)酵前提下），根據(jù)溶氧濃度變化趨勢來了解氧的供需情況。如果降溫后DO迅速回升，說明目前供氧狀況良好；如果降溫后DO值并無回升響應(yīng)，此時DO檢測值很可能屬于“假陽性”，說明罐內(nèi)處于一定程度的缺氧狀態(tài)。

培養(yǎng)液中的溶氧濃度的變化反映了菌體的生理狀況。通常在對數(shù)生長期DO明顯下降，從其下降的速率可估計菌的大致生長情況。DO低谷到來的遲早與低谷時的DO水平隨工藝和設(shè)備條件而異。二次生長時DO往往會從低谷處上升，到一定高度后又開始下降，這是利用第二種基質(zhì)的表現(xiàn)。值得注意的是，在培養(yǎng)過程中并不是維持DO越高越好。即使是專性好氣菌，過高的DO對生長也可能不利。氧的有害作用是通過形成單線態(tài)氧、超氧化物基O^2-、過氧化物基O₂^2-或羥基自由基OH^-，可破壞許多細胞組分。過氧化物基O₂^2-或羥基自由基OH^-，可破壞許多細胞組分。

在遵循先罐壓后攪拌再流量的調(diào)控順序原則上，改善溶氧的手段有以下幾種：

①在通氣中摻入純氧或富氧，使氧分壓提高；

②提高罐壓，能有效增加溶氧，但同時也會增加溶解CO₂的濃度，因為它在水中的溶解度比氧高30倍。這會影響pH和菌的生理代謝，所以提高罐壓要控制在合理的范圍內(nèi)，大腸桿菌發(fā)酵一般控制0.03~0.08MPa以內(nèi)。

③改變通氣量，其作用是增加液體中夾持氣體體積的平均成分；在罐壓較大的情況下增加空氣流量，DO提高的效果顯著。但在罐壓較小的情況下提高空氣流量，對氧溶解度的提高不明顯，反而會使泡沫大量增加，導(dǎo)致逃液。大腸桿菌發(fā)酵常用通氣量為0.5~1.5VVM。

④提高設(shè)備的供氧能力，從改善攪拌考慮更容易收效。改變攪拌器直徑或攪拌槳葉角度可增加功率輸出。另外調(diào)整擋板的數(shù)目和位置，也可使剪切效果發(fā)生變化。比如四斜葉（萊寧A315攪拌槳）比其他槳葉能更有效地應(yīng)用于高密度發(fā)酵中，并能顯著地減少功耗，在相同扭矩和功率下，四斜葉的傳質(zhì)效率比Rushton槳葉高出30%。不同攪拌設(shè)計的溶氧分布效果差別非常大，見下圖：

大腸桿菌發(fā)酵最適溫度是37 ℃，當溫度最適菌體生長時，比生長速率將會增大。隨溫度上升細菌代謝加快，其產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物也會增加。這些副產(chǎn)物會對菌體的生長產(chǎn)生一定的抑制作用。菌體生長過快也會影響質(zhì)粒的穩(wěn)定性。降低培養(yǎng)溫度，菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和生長速率都會下降。同時也減少了有毒代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生和代謝熱的產(chǎn)生。有時降低溫度更有利于目的蛋白的正確折疊及表達。在重組大腸桿菌的發(fā)酵中不同發(fā)酵階段其最適溫度也不同，為了能獲得大量的目的蛋白，首先要保證菌體的量，因此在前期可優(yōu)先考慮菌體的生長，到誘導(dǎo)階段應(yīng)將目的產(chǎn)物的表達放在首位。大腸桿菌的不同克隆，誘導(dǎo)表達的溫度差異比較大，常用的有20度~32度，更高的誘導(dǎo)溫度意味著包涵體生成的概率成倍增加。

     發(fā)酵過程中培養(yǎng)液的pH值變化是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標，是發(fā)酵過程中重要參數(shù)，對微生物的生長和產(chǎn)物的積累有很大的影響。培養(yǎng)基中的碳/氮比不合適，碳源過多，特別是葡萄糖過量或者中間補糖過多或溶解氧不足，致使糖等物質(zhì)的氧化不完全，培養(yǎng)液中有機酸大量積累，會導(dǎo)致pH下降；培養(yǎng)基中碳源缺乏，或培養(yǎng)基中的碳/氮比不當，氮源過多會使pH值上升。

對于帶有誘導(dǎo)型啟動子的重組微生物，選取合理的誘導(dǎo)時機非常重要，一般的誘導(dǎo)時間選在指數(shù)生長后期，而且誘導(dǎo)時的比生長速率最好能控制在0.2之內(nèi)。選在此時誘導(dǎo)，可將菌體的快速生長期與蛋白合成期分開，使這兩個階段互不影響，有利于蛋白的高表達。而且此時已經(jīng)得到了一定量的菌體，從發(fā)酵動力學(xué)角度，以及能耗、物料成本方面，都比較合理。相較于誘導(dǎo)時機，誘導(dǎo)劑濃度并不那么重要，如果誘導(dǎo)時菌濃OD值在50以內(nèi)，那么用0.1mM的IPTG進行誘導(dǎo)就足夠了。

大腸桿菌有氧代謝產(chǎn)乙酸有兩條途徑，分別為丙酮酸氧化酶路徑（poxB）和乙酸激酶/磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶路徑（ackA-pta）。發(fā)酵液中乙酸以HAc 和Ac^－形式共存，HAc能滲透過細胞膜，在細胞內(nèi)（pH約為7.5）再分解為H^＋和Ac^－。由于不斷滲透使胞外HAc和Ac^－之間平衡向HAc移動，結(jié)果引起一個凈電中性H^＋內(nèi)流，降低了胞內(nèi)pH 。細胞自身的穩(wěn)態(tài)機制需要能量以改變胞內(nèi)pH降低趨勢，從而破壞了跨膜質(zhì)子梯度，而跨膜質(zhì)子梯度是氧化磷酸化和其它跨膜運輸所必需。也有報道認為乙酸等短鏈脂肪酸對DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和肽聚糖等的合成均有抑制，而這些大分子物質(zhì)是菌體生長和外源蛋白表達所必需的。通過HPLC在210nm下或者酶聯(lián)反應(yīng)在450nm下比色可以精確測定乙酸濃度。一般認為在好氣性條件下，5～10g/L 的乙酸濃度就能對比生長速率、菌體濃度以及后期蛋白收率等產(chǎn)生可觀測到的抑制作用。當培養(yǎng)液中乙酸濃度大于12g/L 時外源蛋白的表達完全被抑制，當乙酸濃度大于15g/L 時，細胞將會停止生長。

培養(yǎng)基成分對乙酸的產(chǎn)生影響較大， 尤其是碳源的選擇。 研究表明目前最常用碳源的葡萄糖作為碳源時，極易導(dǎo)致乙酸生成，而用甘油取代葡萄糖則可以避免乙酸積累。利用復(fù)合碳源葡萄糖 果糖、葡萄糖 麥芽糖取代單一碳源葡萄糖可改善大腸桿菌細胞代謝碳源流向，更有利于目的產(chǎn)物的表達。

流加補料過程中的碳氮比也很重要。若氮源過高，會使菌體生長過于旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累，氮源不足，則菌體繁殖量少從而影響產(chǎn)量；碳源過多，則容易形成較多的乙酸，抑制菌體生長，碳源不足，則容易引起菌體的衰老和自溶。碳氮比不當還會引起菌體按比例的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，從而直接影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。此外，根據(jù)經(jīng)驗，對于一個穩(wěn)定的發(fā)酵工藝，如果總是在固定的發(fā)酵時間段出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象，而且能排除噬菌體和染菌的可能性，那就可能是因為碳氮比不合理造成的。

比生長速率越高，乙酸產(chǎn)生越多，當比生長速率超過某個值時，乙酸開始產(chǎn)生?？梢酝ㄟ^降低溫度，調(diào)節(jié)酸堿度，控制補料等方法來降低比生長速率。DO-stat，pH-stat, 指數(shù)流加，復(fù)合式流加等發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用對于解決發(fā)酵中的乙酸積累問題起了較大作用。需要注意的是，溶氧反饋和pH反饋調(diào)節(jié)補料的同時，必須要保證充足的溶氧，并嚴格控制pH值，而且補酸堿的速率盡量緩和，不能太快。

較低的比生長速率雖然產(chǎn)酸少，但同時會延緩細胞的生長導(dǎo)致發(fā)酵周期延長,往往最適于細胞生長的比生長速率卻并不適于產(chǎn)物的形成。因此選取合適的比生長速率對于高密度、高表達發(fā)酵有重要意義。大腸桿菌比生長速率：μ=（In N2 - InN1) / (t2-t1)，其中，N1表示時間t1時的單位體積生物量，N2表示時間t2時的單位體積生物量。

大腸桿菌發(fā)酵大多采用補料分批培養(yǎng)，該模式能有效的優(yōu)化微生物培養(yǎng)過程中的化學(xué)環(huán)境，使微生物處于最佳的生長環(huán)境。這種方式一方面可以避免某些營養(yǎng)成分初始濃度過高出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面能夠防止限制性營養(yǎng)成分被耗盡而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成。

葡萄糖為碳源進行補料分批培養(yǎng)重組大腸桿菌時，采用限制性流加的方法控制其濃度在較低的范圍內(nèi)以減少乙酸的生成，是目前高密度發(fā)酵常用的技術(shù)。一個好的流加控制系統(tǒng)必須避免兩種傾向：一是流加過量，補料組分在反應(yīng)器中積累從而對細胞生長和產(chǎn)物形成產(chǎn)生抑制；二是流加不足，這可能會導(dǎo)致細胞必需營養(yǎng)物的缺乏。比如恒溶氧反饋法：菌體代謝時會消耗氧，使溶氧下降，當葡萄糖濃度低到一定程度時菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據(jù)溶氧曲線補加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。

染菌一直是困擾整個發(fā)酵工業(yè)的難題。而在工程菌發(fā)酵中，相比于染菌問題，噬菌體污染更為常見。污染工程菌發(fā)酵的噬菌體包括烈性噬菌體和溫和噬菌體兩種。烈性噬菌體浸染菌體后能夠在宿主菌體內(nèi)快速復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌，極短時間內(nèi)就可使發(fā)酵液澄清化（菌體剛開始裂解會釋放核酸物質(zhì)使發(fā)酵液變得粘稠，隨后逐漸澄清）；溫和噬菌體感染宿主菌后并不馬上開始增殖。而是將其基因整合于細菌染色體上，隨細菌染色體的復(fù)制而復(fù)制，并隨細菌分裂而分配至子代細菌的染色體中，形成前噬菌體，這個過程稱為溫和噬菌體的溶原性生長周期。在某些理化或生物因素的誘導(dǎo)下，整合的前噬菌體脫離宿主菌染色體，產(chǎn)生新的子代噬菌體，并使宿主菌裂解，這個過程叫溶菌性生長周期。

1.配制培養(yǎng)基：

LB液體培養(yǎng)基（1000ml水,10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化鈉）、1.5%的固體培養(yǎng)基、0.7%的半固體培養(yǎng)基；

2. 倒平板：將1.5%的固體培養(yǎng)基溶化，每個平板倒10-15ml的1.5%固體培養(yǎng)基，然后靜置至平板上沒有水珠為宜；

3. 分裝0.7%的半固體培養(yǎng)基：將0.7%的半固體培養(yǎng)基加熱溶化，然后用5ml的移液槍向每個試管加入5ml的半固體培養(yǎng)基；試管的數(shù)量和上一步平板數(shù)是相同的；

4. 等到試管中培養(yǎng)基溫度降至40℃左右時（不燙手），迅速向試管中加入100ul敏感菌和100ul的待測噬菌體液，搖勻；

5. 將搖勻好的該培養(yǎng)基迅速倒入之前已倒有1.5%固體培養(yǎng)基平板中，晃動平板，使其鋪滿平板，靜置；

6. 待所有平板倒好后，將其放入30℃恒溫箱中培養(yǎng)12h左右，即可觀察有無噬菌斑。

1. 從菌種構(gòu)建開始，克隆菌種的感受態(tài)細胞及其它試劑要保證純凈沒有被污染；

2. 發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣系統(tǒng)要定期消毒并檢查；

3. 發(fā)酵種子活化的環(huán)境要保持潔凈，并定期消毒；

4. 發(fā)酵罐接種時要無菌操作，發(fā)酵過程取樣后的廢液要進行收集滅菌處理；

5. 發(fā)酵過程的尾氣要通入吸收液處理后再排掉；

6. 定期檢修發(fā)酵罐避免消毒死角的存在，發(fā)酵系統(tǒng)中的補料設(shè)施也要進行檢查；

7. 發(fā)酵場所的地溝，排水池等要保持清潔，保證無活菌排放，并定期消毒；

1. 暫停發(fā)酵生產(chǎn)工作，用紫外燈照射加甲醛熏蒸的方式對整個發(fā)酵場所進行消毒一個月；

2. 對現(xiàn)有菌種庫做嚴格的噬菌體檢測，一旦發(fā)現(xiàn)污染痕跡，馬上和其它菌種隔離并進行滅活處理；

3. 用甲醛、臭氧或二氧化氯熏蒸發(fā)酵小試間、菌種室等位置；

4. 用化學(xué)消毒劑（譬如75%酒精、新潔爾滅、二氧化氯稀溶液等）清潔試驗臺、實驗室墻面和設(shè)備等表面；

5. 一旦爆發(fā)噬菌體污染，停止任何形式的活菌排放，杜絕或盡量減少活菌開放性操作；

6. 多點取樣進行噬菌體培養(yǎng)驗證，以檢驗滅活效果，直至無噬菌斑出現(xiàn)方可復(fù)產(chǎn)。