摘要：食源性致病菌已成為當(dāng)前威脅世界食品安全的關(guān)鍵因素，因此建立食品微生物全套快速檢測方略對確保食品質(zhì)量、保障人類健康意義重大。文中從食品微生物檢測的前處理、增菌、分離和富集以及檢測各個環(huán)節(jié)綜述了國內(nèi)外最新研究進展，為建立一體化、實時食品微生物檢測平臺提供一定的基礎(chǔ)。

隨著人們生活水平的日益提高及公眾安全意識的不斷增強，食品安全作為一個關(guān)系國計民生的重大世界性公共衛(wèi)生問題也備受關(guān)注。在諸多食品安全檢測項目中，微生物污染是引發(fā)食源性疾病的最主要因素。因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的現(xiàn)代微生物檢測方法在食品安全監(jiān)控中舉足輕重。而食品微生物檢測大致可分以下幾個步驟，樣品前處理、增菌、分離和濃縮到檢測判定等各個環(huán)節(jié)，本文則著重解析探討食品微生物快速檢測的整套解決方略。

傳統(tǒng)微生物檢測方法包括形態(tài)觀察、生化鑒定及血清學(xué)分型等冗繁的操作，已不能滿足現(xiàn)代食品微生物檢測對靈敏度、特異性和時效性的要求。因此，在基因、蛋白或是代謝水平上，融匯貫通生物學(xué)、物理學(xué)和化學(xué)等學(xué)科的最新技術(shù)，開發(fā)新的現(xiàn)代檢測方法已成為當(dāng)今食品微生物檢測領(lǐng)域的一大熱點。

分子生物學(xué)方法此類方法在基因水平上對靶標(biāo)微生物進行檢測，尤其適用于難培養(yǎng)或抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜微生物的鑒定及分型，主要包括ＰＣＲ、核酸分子雜交及基因芯片等技術(shù)。這次主要分析以PCR為主及其相關(guān)的快檢手段。

ＰＣＲ是一種體外酶促合成特定ＤＮＡ片段的技術(shù)，它通過以變性、退火和延伸３個步驟為一個周期的循環(huán)反應(yīng)實現(xiàn)產(chǎn)物的指數(shù)級增長。早在１９９０年代，ＰＣＲ以其高靈敏度、特異性及快速等特點已在微生物檢測中得到廣泛應(yīng)用。近年來，隨著常規(guī)ＰＣＲ的不斷成熟，其衍生技術(shù)也被逐漸開發(fā)并應(yīng)用于微生物檢測。相對于擴增單一靶基因的常規(guī)ＰＣＲ，多重ＰＣＲ通過在同一反應(yīng)體系中加入多對特異性引物來實現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時擴增多個目標(biāo)基因，可用于同時檢測多種微生物或通過多基因交叉確認來進行特定微生物鑒定或種下分型。如針對金黃色葡萄球菌的２３Ｓ ｒＲＮＡ、耐熱核酸酶、血漿凝固酶以及８種腸毒素的編碼基因分別設(shè)計特異引物，建立多重ＰＣＲ方法鑒別乳制品中該菌產(chǎn)腸毒素的類型；分別以沙門氏菌和單增李斯特菌基因和金黃色葡萄球菌基因作為靶標(biāo)設(shè)計３對引物，通過優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了能同時快速地檢測食品中３種致病菌的三重ＰＣＲ法。

實時熒光定量PCR（quantitative real-time pcr，ｑＲＴ－ＰＣＲ）技術(shù)是于１９９６年推出的一種通過監(jiān)測ＰＣＲ產(chǎn)物熒光信號的實時累積來定性或定量分析起始模板的方法。該法全程封閉式反應(yīng)且無需ＰＣＲ后處理，避免了交叉污染及溴化乙錠等有毒物質(zhì)的使用，具有特異性強、高度自動化等優(yōu)點。通過選取特異性基因設(shè)計引物及探針，ｑＲＴ－ＰＣＲ法近年來已在多種致病細菌、霉菌、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指標(biāo)的定性和定量檢測中被廣泛應(yīng)用。許多研究者還在此基礎(chǔ)上進行方法改良，進一步提高檢測效率。如結(jié)合ＩＭＳ，ｑＲＴ－ＰＣＲ法無需前增菌即可準(zhǔn)確、快速地檢測大腸桿菌 O157:H7，有效縮短了檢測周期。

盡管上述ＰＣＲ及其衍生技術(shù)具有高靈敏度、快速等優(yōu)點，但方法實施所需的昂貴儀器設(shè)備嚴(yán)重限制了其在我國食品檢測機構(gòu)的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是于2000年開發(fā)的一種無需擴增儀、結(jié)果可通過擴增副產(chǎn)物的濁度直觀判定的新型核酸擴增法。它通過高效鏈置換技術(shù)，可在１ｈ內(nèi)于恒溫條件下特異擴增ＤＮＡ達109～1010個拷貝。該法無需經(jīng)歷復(fù)雜變溫循環(huán)擴增過程，混樣后僅需一個恒溫反應(yīng)器即可在短時間內(nèi)完成，較之其他ＰＣＲ法具有無以比擬的快速、簡便、高靈敏及直觀等優(yōu)點，因而在食品微生物檢測領(lǐng)域越發(fā)受到青睞。２０１１年，我國也發(fā)布并實施了針對出口食品中１５種致病菌的ＬＡＭＰ檢測方法的出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) SN/T2754.12-2011。

但LAMP檢測方法也同樣存在一定的缺陷，比如它的恒溫條件是需要達到60-65℃，同樣需要依靠一些特定儀器，也就導(dǎo)致不能做到現(xiàn)場的檢驗檢測，同時也易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

酶促重組等溫擴增（ERA）技術(shù)，憑借其技術(shù)在核酸檢測領(lǐng)域開發(fā)了三大核心（www.），1、體溫擴增技術(shù)，能在恒溫條件下，將痕量的核酸模板擴增到可以檢出的水平；2、單分子熒光檢測技術(shù)，集恒溫擴增與熒光信號檢測于一體，可實現(xiàn)擴增過程的實時檢測；3、核酸快速釋放技術(shù)，為實驗節(jié)省更多的時間。該方法低溫條件下（25-42℃）可對痕量的靶DNA片段進行特異性的擴增，在最適溫度35-40℃時，擴增反應(yīng)時間僅需15分鐘，其低溫適應(yīng)性和靈敏度等方面取得了重大突破并達到國際先進水平，而且擺脫國外專利壁壘，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌、副溶血性弧菌、李斯特氏菌等病原體檢測。

總而言之，現(xiàn)代食品衛(wèi)生安全對于社會公民的健康非常重要，也是大家非常關(guān)注的一個問題，現(xiàn)在食品安全問題頻發(fā)，引起了大家的廣泛討論，我們需要不斷對食品安全檢驗技術(shù)進行完善，尋找快速、精準(zhǔn)，簡便的檢驗方式，傳統(tǒng)的檢驗方式無法滿足現(xiàn)代的需求，目前興起的基因探針技術(shù)以及全自動微生物檢測系統(tǒng)的應(yīng)用，獲得了非常好的效果，對微生物檢驗方法起到了非常好的改變，提升了該事業(yè)的科技水平，因此其未來的發(fā)展前景不可限量，我們對食品微生物檢驗方法進行研究分析，也是希望能夠促進該項事業(yè)的發(fā)展。