細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)的意義

細(xì)胞增殖是指細(xì)胞在周期調(diào)控的因子下，通過DNA復(fù)制等反應(yīng)，完成細(xì)胞分裂的過程。增殖檢測一般是分析分裂中的細(xì)胞數(shù)量的變化，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞的生長狀態(tài)及活性，目前廣泛應(yīng)用于腫瘤生物學(xué)，分子生物學(xué)，藥代動力學(xué)等領(lǐng)域。

腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化過程

細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)的分類

細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案和目的不同分為以下幾種：

1. 細(xì)胞代謝活性檢測  通過檢測活細(xì)胞相關(guān)的物質(zhì)的含量（如蛋白質(zhì)、酶）等間接地測定待活細(xì)胞的數(shù)量來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。

• 特點(diǎn)：間接的方法，反應(yīng)的是細(xì)胞活性而非是否在增殖；

• 常見實(shí)驗(yàn)舉例：MTT、XTT、MTS、CCK8法及SRB法；

• 應(yīng)用：細(xì)胞活力、藥物作用的毒性，適合高通量分析實(shí)驗(yàn)。

2. 細(xì)胞DNA合成檢測   通過測定細(xì)胞的DNA合成含量來評價(jià)細(xì)胞的增殖能力。

• 特點(diǎn)：直接測定DNA合成是檢測細(xì)胞增殖最準(zhǔn)確方法；

• 常見實(shí)驗(yàn)舉例：BrdU和EdU；

• 應(yīng)用：細(xì)胞DNA修復(fù)，分化及細(xì)胞標(biāo)記物追蹤等。

3. ATP濃度檢測  利用熒光素酶Luciferase反應(yīng)細(xì)胞ATP的含量，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞活性。

• 特點(diǎn)：結(jié)果靈敏；

• 常見實(shí)驗(yàn)舉例：熒光素酶催化反應(yīng)；

• 應(yīng)用：高通量細(xì)胞增殖檢測和篩選。

4. 細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測  通過檢測增殖細(xì)胞特異性地表達(dá)某些特定蛋白，如Ki-67，PCNA等常作為人體細(xì)胞增殖的標(biāo)志。

• 特點(diǎn)：反應(yīng)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖能力，但是需組織切片不適合高通量；

• 常見實(shí)驗(yàn)舉例：細(xì)胞增殖的標(biāo)志物的免疫組化等；

• 應(yīng)用：體內(nèi)腫瘤組織。

5. 染料排斥法  活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。適合少量細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)，廣泛用于繪制細(xì)胞生長曲線等。

以上方法我們一般是根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?xì)胞類型來決定最終的選擇。

本期我們先為大家介紹了一下，第一大類：基于細(xì)胞代謝活性的檢測：包括酶活如MTT、MTS、CCK8等；蛋白含量的SRB實(shí)驗(yàn)。又可統(tǒng)稱為比色法，主要基于顏色的變化來反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量，十分適合高通量藥物篩選，進(jìn)而計(jì)算藥物的IC50。

第一類：MTT、MTS、CCK8等

這一類的實(shí)驗(yàn)原理基本類似，細(xì)胞線粒體的脫氫酶可將MTT、MTS、CCK8等試劑還原為有色產(chǎn)物，可在酶標(biāo)儀上于不同波長（490nm、490nm、450nm）處檢測OD值，在一定范圍內(nèi)，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)目成正比，進(jìn)而反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量。

MTT是最早出現(xiàn)的檢測方式，于1983年由Mosmann建立的方法，MTT為四唑鹽，但是存在一定的缺陷，特別是還原產(chǎn)物不溶水，且對細(xì)胞有較大毒性，因此限制了其使用，目前基于MTT開發(fā)的MTS、CCK8等，應(yīng)用更加廣泛。

MTT對細(xì)胞的毒性：

A圖為剛加入MTT（0.5mg/ml）NIH-3T3細(xì)胞形態(tài)，B圖為加入MTT后4h，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變[1]。

如下為MTS的原理：MTS被乳酸脫氫酶還原為黃色的Formazan

1. MTS的操作步驟：

1.  細(xì)胞接種到96孔板培養(yǎng)；
   

2. 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)幾天；

3.  培養(yǎng)完成后，每孔加入MTS和PMS（20:1比例）混合溶液后繼續(xù)孵育2-3h，現(xiàn)在大部分公司提供的商品化MTS已處理好可以直接加入進(jìn)行檢測；

4.  終止培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀，在490nm處測定吸光度值；

注意：避光操作。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有良好的線性，MTS實(shí)驗(yàn)中吸光度值應(yīng)保持在0.75-1.25之間較好；腫瘤細(xì)胞一般要根據(jù)其生長速度及本身代謝情況進(jìn)行鋪板。

優(yōu)點(diǎn)：

1. 操作簡單，比MTT高效，產(chǎn)生水溶性的Formazan，無需用DMSO溶解；

2. 由于MTS被還原產(chǎn)物顏色較深，吸光度值變異范圍大，使測定更加敏感準(zhǔn)確；

3. 快速，作用時(shí)間2-3小時(shí)為最佳，而MTT需4小時(shí)；

4. 重復(fù)性好，還原產(chǎn)物穩(wěn)定。

2. CCK8法的操作步驟：

1.  細(xì)胞接種到96孔板培養(yǎng)；
   

2.  培養(yǎng)完成后，每個(gè)孔中加入10μLCCK8試劑；

3.  37℃培養(yǎng)箱中孵育1-4h；

4.  使用酶標(biāo)儀，在450nm處測定其吸光度值。

優(yōu)點(diǎn)：

1. 使用方便，檢測快速；

2. 靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；

3. 對細(xì)胞毒性??；

4. 產(chǎn)物水溶性，不需換液，尤其適用于懸浮細(xì)胞。

缺點(diǎn)：與MTT相比，CCK-8和MTS的價(jià)格貴。

注意：避光操作。

第二類：SRB比色法

SRB磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B)，一種粉紅色陰離子染料，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)堿性氨基酸結(jié)合；在540 nm波長下產(chǎn)生吸收峰，在一定范圍內(nèi)，吸光度值與活細(xì)胞數(shù)目成正比。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)好的待檢測細(xì)胞量的96孔板樣品；

2. 每孔加入TCA（50%的三氯乙酸）固定細(xì)胞，4℃放置1h；

3. 棄去固定液，蒸餾水洗5-6次，室溫晾干或吹風(fēng)機(jī)吹干；

4. 每孔中加入SRB染液100μL，室溫放置10-30min；

5. 棄去染液，用1%醋酸洗滌，直至在白色紙上倒扣輕拍無明顯染料顏色；

6. 每孔加入150μLTris溶液；

7. 用酶標(biāo)儀在515nm處測定吸光度值；

注意：SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果中OD值在0.8-1.2之間時(shí)線性較好；腫瘤細(xì)胞一般要根據(jù)其生長速度及本身代謝情況進(jìn)行鋪板。

優(yōu)點(diǎn)：不存在孵育時(shí)間限制，即細(xì)胞固定后以放置較長時(shí)間；與MTS,CCK8相比，檢測時(shí)間可以自己掌握，不受限制，更適合大規(guī)模試驗(yàn)。

缺點(diǎn)：操作步驟繁瑣，不適合懸浮細(xì)胞。

如下圖，圖A表示肺癌細(xì)胞系H441細(xì)胞數(shù)量與SRB染料對應(yīng)的吸光度值成線性關(guān)系，B圖顯示SRB方法來測試miRNA對兩株肺癌細(xì)胞細(xì)胞系的增殖影響[2]。

常見問題匯總

MTS、CCK8及SRB法等方法，如何確定選擇哪個(gè)？

大家可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和預(yù)算進(jìn)行選擇，價(jià)格方面，CCK8和MTS大于SRB，但是SRB操作較繁瑣，但個(gè)人覺得SRB線性更好，但不適用于懸浮細(xì)胞。

OD不在線性范圍內(nèi)，怎么辦？誤差大嗎？

如MTS要求0.8，（通常來說，比色法測定細(xì)胞增殖試劑盒中都會注明最佳反應(yīng)時(shí)間，通常MTS/CCK8反應(yīng)最佳時(shí)間為1h-4h，我們實(shí)驗(yàn)初期固定孵育時(shí)間如1h，通過比較不同細(xì)胞量的OD值來確定實(shí)驗(yàn)細(xì)胞鋪板量，根據(jù)具體情況進(jìn)行調(diào)整。

對細(xì)胞密度有要求嗎？

不同類型的細(xì)胞，代謝活性不同，影響細(xì)胞代謝的因素也會影響細(xì)胞數(shù)和吸光值的關(guān)系。細(xì)胞在高細(xì)胞密度時(shí)會產(chǎn)生接觸抑制，進(jìn)而代謝活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)和吸光度值的非線性關(guān)系。對大多數(shù)腫瘤細(xì)胞，雜瘤細(xì)胞和纖維母細(xì)胞系，推薦5000cells/孔作為增殖研究的起始細(xì)胞數(shù)，雖然少于1000個(gè)細(xì)胞通常也可被檢測。血淋巴細(xì)胞例外，一般需要25,000–250,000細(xì)胞/孔才能獲得足夠的吸光值。可以參考下圖的實(shí)驗(yàn)來確定細(xì)胞數(shù)。

 本期我們就為大家介紹到這這里了，主要講述了比色法的幾種常見實(shí)驗(yàn)，我們要根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮图?xì)胞類型來選擇最合適自己的方法。下一期我們繼續(xù)為大家介紹剩余的幾種檢測方法。

參考文獻(xiàn)

1. Riss T L, Moravec R A, Niles A L, et al. Cell viability assays[J]. 2016.

2. Kasinski A L, Kelnar K, Stahlhut C, et al. A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J]. Oncogene, 2015, 34(27): 3547-3555

腫瘤細(xì)胞生物學(xué)

認(rèn)識實(shí)驗(yàn)室中的腫瘤細(xì)胞

如何進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的正確培養(yǎng)？

原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)？

如何應(yīng)對細(xì)胞污染？

細(xì)胞鋪板如何均勻？

腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)簡介

細(xì)胞克隆形成

細(xì)胞生長測定

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