細胞增殖檢測已經廣泛應用于分子生物學、腫瘤生物學、免疫學和大規(guī)模藥物篩選等研究領域。檢測方法主要分為兩類：一類是直接測定進行分裂的細胞數(shù)來評價細胞增殖能力，如Ki67、BrdU以及EdU細胞增殖檢測等；一類是通過測定活性細胞數(shù)目來間接反映細胞增殖能力，如MTT、CCK-8等。

在上述檢測方法中，MTT法風靡各大實驗室，一度成為科研老臘肉和小鮮肉的一項必備的實驗技能。雖然MTT法由來已久且流傳甚廣，但是對于初次接觸MTT的科研小白來說，要想在短時間內將MTT法練就得“穩(wěn)（重復性好）、準（準確性高）、狠（操作速度快）”也是一個不小的挑戰(zhàn)。

任性嬌柔的細胞以及操作細節(jié)的忽視很容易就把你拉進“大幺蛾子沒有，小幺蛾子不斷”的悲催循環(huán)中。諸如細胞鋪板不均勻、鋪好的細胞狀態(tài)差、復孔之間的吸光度差異大，以及吸光度值忽高忽低等各類小幺蛾子在MTT實驗中屢見不鮮。

那么科研小鮮肉如何快速從老臘肉手里練就“穩(wěn)、準、狠”的MTT技能呢？讓小編慢慢告訴你。

1、MTT溶液配制

將MTT粉末用PBS配制成5 mg/mL的溶液，過濾除菌分裝，避光儲存于-20℃。臨用前取出放置4℃。

2、細胞接種

將狀態(tài)良好的細胞以合適的密度接種于96孔板是MTT法的一個關鍵步驟。細胞的接種密度與細胞的種類以及給藥孵育的時間密切相關，過多或過少的細胞密度都會影響實驗結果的準確性和重復性。

因此在正式做MTT實驗前不能依賴網上提供的MTT方法，需要通過預實驗來確定細胞的接種密度。

1)  收集對數(shù)生長期的MCF-7細胞，用完全培養(yǎng)基將細胞濃度稀釋成2000、3000、4000、5000、6000和8000 cells/mL的細胞懸液，以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中，每個細胞濃度接種3孔即可，放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)；

注意：接種細胞時先將細胞懸液吹打均勻，然后倒入加樣槽內，用多通道移液器吸取細胞懸液后將槍頭貼96孔板的孔壁添加細胞懸液，添加完成后不要晃動96孔板，直接放入細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。如此操作可以大大提高接種的均勻度，而且還可以使細胞在孔板內的均勻分布，不聚集。

2)  在接種后的第48、72和96 h取出96孔板，倒置顯微鏡下觀察孔內細胞的生長匯合程度并拍照保存；

小編以96 h的觀察結果為例（圖1）。從圖1中可以看出，以4000 cells/mL濃度接種的孔內細胞在培養(yǎng)96 h后生長匯合約80%~90%，而6000~8000 cells/mL濃度的孔內細胞已經長滿，而細胞在長滿狀態(tài)下會發(fā)生接觸抑制生長現(xiàn)象。

因此，后續(xù)若要采用MTT法考察藥物作用于MCF-7細胞72 h后對細胞的毒性特性（或細胞增殖抑制），那么在接種MCF-7細胞時則宜按4000 cells/mL的細胞濃度接種于96孔板。這里選擇觀察96 h是將細胞接種后貼壁24 h與加藥孵育72 h計算在了一起。

3)  確定好細胞接種濃度之后，按照上述方法以4000 cells/mL細胞濃度接種于96孔板中，并培養(yǎng)24 h使細胞貼壁。

注意：96孔板的外周孔共36孔不要接種細胞，用100 μL PBS填充。接種細胞時需要定時搖晃加樣槽，防止加樣槽內細胞懸液沉降，進而導致多通道移液器每次移取的細胞懸液數(shù)量不一致。

3、加藥處理

1)  取出接種細胞的96孔板，吸棄孔內培養(yǎng)基，對照組加入200 μL完全培養(yǎng)基，加藥組加入180 μL完全培養(yǎng)基，每組設置6個復孔為宜；

2)  將藥物（或藥物的DMSO溶液）用完全培養(yǎng)基稀釋成10倍給藥濃度的系列梯度濃度給藥溶液；

3)  以每孔20 μL的量加入稀釋的系列濃度梯度給藥溶液，然后放入細胞培養(yǎng)箱內孵育72 h。

4、測定

1)  孵育結束后，取出96孔板，吸棄孔內藥物溶液，用PBS清洗2次后加入20 μL MTT溶液，然后放入細胞培養(yǎng)箱內孵育4 h；

2)  孵育結束后，吸棄孔內MTT溶液，加入150 μL DMSO，輕微震蕩10 min后用酶標儀在490 nm處測定吸光度值，并計算出平均值和SD（圖2）。

注意：吸棄MTT溶液時適當傾斜96孔板，然后用多通道移液器貼壁吸取MTT溶液。

5、計算IC50值

1)  將濃度轉換為對數(shù)形式并將給藥組吸光度均值除以對照組吸光度均值得到細胞存活率均值（圖3）；

2)  打開Graphpad Prism 7.00，選擇XY圖（圖4）；

3) 將圖3中的數(shù)據復制到Graphpad中，點擊Analyze（圖5），選擇Nonliner regression (curve fit) （圖6），點擊OK；

4) 選擇Dose-response-Inhibition項下的“[Inhibitor] vs. normalized response-Variable slope”（圖7），點擊OK；

5) 從圖8中可以得到軟件模擬計算出的藥物IC50為19.05ng/mL。選擇圖8中Graphs項下的Data 1可以得到數(shù)據圖（圖9），經過簡單的調整就可以得到最終的數(shù)據圖（圖10）；

6、MTT法的更新版

雖然MTT法在細胞增殖檢測方面應用廣泛，但由于 MTT 法形成的甲臜不溶于水，需要先吸棄MTT溶液然后加入DMSO溶解之后才能測定，這不僅使測定的工作量增加，而且在吸棄MTT溶液時不可避免地會帶走甲臜，因此也會降低實驗結果的準確性和重復性。

因此檢測試劑公司急科研小白之所急，瞄準商機開發(fā)了CCK-8試劑盒。與MTT法相比，CCK-8所產生的產物溶于水，因此在加入CCK-8孵育后立即可以進行吸光度檢測，既提高了實驗效率又增強了實驗的重復性。

盡管有了MTT的更新版，但是前期實驗設計包括細胞密度的確定以及藥物濃度范圍的篩選依然是該實驗的關鍵。