最近發(fā)現(xiàn)由酰基-輔酶A（Acyl-CoA）介導(dǎo)的?；磻?yīng)（見(jiàn)圖1）可能是表觀(guān)遺傳過(guò)程中的一種新調(diào)節(jié)機(jī)制。另外，?；磻?yīng)也與細(xì)胞代謝和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過(guò)程密切相關(guān)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究證明蛋白質(zhì)上的賴(lài)氨酸殘基會(huì)發(fā)生?；磻?yīng)，得到系列蛋白賴(lài)氨酸?；a(chǎn)物。這類(lèi)酰化反應(yīng)是近些年新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾類(lèi)型，而針對(duì)蛋白酰化反應(yīng)，現(xiàn)有的分析方法如蛋白免疫印跡法(Western blotting)和蛋白質(zhì)組學(xué)等尚未能同時(shí)分析多種蛋白?；a(chǎn)物，無(wú)法進(jìn)行絕對(duì)定量分析。該研究中，作者通過(guò)組合酶水解法將蛋白水解為單個(gè)氨基酸殘基，接下來(lái)建立HPLC-MS/MS方法同時(shí)鑒定和定量了小鼠肝臟、腎臟、心臟和腦組織中14種蛋白質(zhì)?；附猱a(chǎn)物，檢測(cè)水平在nmol/L水平，其中還包括了4種新鑒定的?；?lài)氨酸結(jié)構(gòu)（乙酰乙酰化、異戊?；?、2-甲基丁?；图谆投辊；龋?。

圖1 ?；?輔酶A介導(dǎo)的蛋白?；磻?yīng)原理

    作者首先收集3至4個(gè)月大的C57BL/6J小鼠的肝臟、腎臟、心臟和腦組織并在液氮中速凍，再將冷凍器官轉(zhuǎn)移至蛋白裂解專(zhuān)用EP管中，加入含蛋白酶抑制劑（無(wú)EDTA）的PBS溶液進(jìn)行樣品勻漿。離心后將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，加入裂解緩沖液（含4％SDS、100 mM HEPES和20 mM DTT，pH 8.0），使用超聲波破碎儀對(duì)樣品進(jìn)行高功率超聲10個(gè)循環(huán)，快速離心樣品，將樣品離心后的上清液轉(zhuǎn)移至EP管中，在-20℃下加入4倍體積的冰丙酮過(guò)夜沉淀蛋白，4°C下離心30 min，然后將沉淀用4°C的80％丙酮水溶液（v/v）洗滌兩次，氮?dú)獯蹈?，沉淀樣品使用PBS溶液進(jìn)行樣品復(fù)溶。

    接下來(lái)，作者將上述復(fù)溶樣品分別進(jìn)行酶水解和酸水解處理，首先使用組合酶切法對(duì)復(fù)溶樣品進(jìn)行酶切，加入0.3單位的鏈霉蛋白酶E（ProE）孵育48 h，ProE中包含來(lái)源于灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）的肽鏈內(nèi)切酶（endopeptidases）和外切酶（exopeptidases），其中肽鏈內(nèi)切酶可以使蛋白結(jié)構(gòu)更適于外切酶的酶切作用，外切酶將蛋白酶切為多肽片段。接下來(lái)加入0.1單位的羧肽酶（carboxypeptidase Y）和0.5單位的氨基肽酶（aminopeptidase）孵育24 h，即可進(jìn)一步將多肽片段酶解為單個(gè)氨基酸殘基；酸水解采用強(qiáng)酸（鹽酸）進(jìn)行水解，可保證蛋白完全水解為氨基酸。將酸水解效率規(guī)定為100%，用水解產(chǎn)物中亮氨酸的量來(lái)表示酶水解的效率。采用亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，通過(guò)茚三酮反應(yīng)，用分光光度計(jì)在546nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組織酶水解和酸水解樣本的吸光度，帶入亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各樣本中的亮氨酸濃度，以酶水解和酸水解測(cè)定的亮氨酸濃度比計(jì)算得到各組織樣本的酶水解效率。肝、腎、心臟和腦組織的氨基酸平均酶切效率分別為86%、85%、88%和88%等。

    基于質(zhì)譜裂解規(guī)律和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)?；被徇M(jìn)行鑒定，最終鑒定得到14種?；?lài)氨酸，圖2為2-甲基丁酰賴(lài)氨酸的二級(jí)質(zhì)譜信息。進(jìn)一步建立HPLC–MS/MS方法對(duì)酶水解樣品進(jìn)行分析，質(zhì)譜系統(tǒng)為AB公司的API4000液質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為Waters XSelect HSS T3（250×3.0mm，5μm）色譜柱，流速0.7mL/min，柱溫為25℃。流動(dòng)相：A=水，B=70%甲醇水溶液（v/v），均添加了七氟丁酸作為流動(dòng)相添加劑，梯度洗脫。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式測(cè)定，質(zhì)譜的優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表1，分析物的EIC提取色譜圖見(jiàn)圖3，小鼠各組織器官勻漿液中的?；?lài)氨酸含量見(jiàn)表2.

圖2 2-甲基丁酰賴(lài)氨酸的二級(jí)質(zhì)譜信息

A：標(biāo)準(zhǔn)品：B，肝組織勻漿酶解樣品

表1 14種?；被針?biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜參數(shù)

圖3 14種酰化氨基酸的EIC提取色譜圖

表2 小鼠各組織勻漿液中的?；?lài)氨酸含量

    該研究未在蛋白水平研究活性酰基-輔酶A介導(dǎo)的蛋白?；笮揎棧菍?duì)水解得到的?；?lài)氨酸進(jìn)行了表征，作者開(kāi)發(fā)了用于分析生物樣品中酰化賴(lài)氨酸的HPLC-MS/MS分析方法，總共在小鼠肝、腎、心臟和腦組織中勻漿中鑒定和定量了14種酰化賴(lài)氨酸，其中包括了4種新鑒定的?；?lài)氨酸結(jié)構(gòu)（乙酰乙?；愇祯；?、2-甲基丁酰化和甲基巴豆?；龋瑸檠芯康鞍柞；笮揎椃磻?yīng)提供一定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

Tim Baldensperger, Simone Di Sanzo , Alessandro Ori, Marcus A. Glomb*. Quantitation of Reactive Acyl-CoA Species Mediated Protein Acylation by HPLC–MS/MS, Anal Chem. 2019, 91, 19, 12336-12343.

文獻(xiàn)整理：李元元；編輯：生寧、張金蘭；第155期