神經(jīng)退行性病癥（ND）為各種所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的異常削弱情況的總稱，幾乎所有形式的ND之間的一個共同點是嚴重缺乏可行的治療方案，現(xiàn)有療法的局限性導致大家對新型療法、基于設備的治療、物理治療和外科手術方案的更大興趣。

近幾十年來，基因組水平的治療形式引起了人們的極大興趣，新的CRISPR/Cas9基因編輯工具由于有效性、安全性和靈活性而不斷被探索。目前，CRISPR技術正在開發(fā)用于直接治療患者，相關臨床試驗已經(jīng)在國內(nèi)開始進行，并將很快在美國展開。大多數(shù)其它用于神經(jīng)變性疾病的基因療法已經(jīng)達到了早期臨床試驗，但使用CRISPR技術來治療神經(jīng)退行性疾病仍處于早期臨床前階段。

CRISPR/Cas9已用于在神經(jīng)元內(nèi)進行插入和缺失突變，從而在體內(nèi)中產(chǎn)生穩(wěn)定的基因敲除，這不僅展示了空間和時間上控制CNS中的基因表達的能力，還表現(xiàn)出對改善ND病理學中起關鍵作用的表觀遺傳方面的突破。

另外，在各種形式的治療遞送載體（例如合成納米顆粒和脂質(zhì)體載體）中，病毒通過在體內(nèi)擁有更高的基因傳遞性能，載體脫穎而出。而非病毒遞送工具在很大程度上被認為不足以用于治療慢性神經(jīng)退行性疾病，因為它們僅限于對基因表達形成瞬時修飾的潛在影響。

病毒載體可確定基因編輯的組織特異性/細胞類型特異性以及具有通過腦脊液或血流局部進入大腦的能力，使其成為在CNS中使用CRISPR/Cas9等遺傳工具的強有力的遞送技術，已在研究模型中表現(xiàn)出顯著的治療潛力。

為此，小編在下文重點介紹了聯(lián)合病毒載體與CRISPR/Cas9在治療神經(jīng)退行性疾病的最新進展，其中涉及的兩種主要類型的載體是慢病毒載體和腺相關病毒（AAV）載體。

阿爾茲海默癥（AD）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為記憶和認知功能障礙，語言和行為能力缺失，患者后期表現(xiàn)出嚴重的失憶癥和運動功能減弱，最終導致死亡。

β淀粉樣蛋白是大腦中淀粉樣斑塊的主要成分，而阿爾茲海默癥患者大腦中的淀粉樣斑塊積累能夠誘發(fā)患者腦細胞死亡。這也開啟了基因治療的有效策略，例如具有病毒載體的CRISPR/Cas9，以改變異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而限制異常蛋白質(zhì)的積累。許多AD遺傳易感因素，如載脂蛋白E（APOE）和早老素（PSEN），已被歸類為AD發(fā)展的關鍵參與組分，也為CRISPR/Cas9系統(tǒng)開辟了潛在靶點。

今年4月，瑞典烏普薩拉大學的Martin Ingelsson及其同事發(fā)表了首例使用CRISPR/Cas9糾正患者細胞和小鼠淀粉樣蛋白前體蛋白的瑞典型突變（APPswe），治療早發(fā)性常染色體顯性遺傳AD（ADAD）。

他們敲除了突變的APPswe以減少患者細胞Aβ的產(chǎn)生，同時使野生型等位基因保持完整。使用相同的策略，他們還修改了攜帶人APPswe等位基因的轉基因小鼠的基因組，但尚不清楚是否會影響AD病理。該研究成果表明：早發(fā)性AD病例可能受益于APPswe的破壞。

此外，基于AD的誘導多能干細胞（iPSC）疾病模型，哥本哈根大學與西奈山伊坎醫(yī)學院的兩項研究證明：利用CRISPR/Cas9糾正患者來源的iPSC中的PSEN1和PSEN2家族性突變，可以實現(xiàn)電生理學和β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌的正?；?。

亨廷頓氏?。℉D）

亨廷頓氏?。℉untington's disease, HD）是一種遲發(fā)性神經(jīng)退行性遺傳病，患者的發(fā)病年齡一般為30～50歲，主要病因是亨廷頓基因（HTT）異常，從而造成代謝產(chǎn)物亨廷頓蛋白（Htt）異常。

這些異常蛋白質(zhì)積聚成塊，主要侵害基底節(jié)和大腦皮質(zhì)，具有高度的區(qū)域選擇性。基底節(jié)運動通路受損引發(fā)運動過度，即HD的主要臨床癥狀——舞蹈樣動作；大腦皮層受損導致患者認知功能障礙，晚期多見癡呆。

HD的患病率在不同人群中變異很大，在美國，HD患病率為萬分之一，患者需要接受全天候護理，生活質(zhì)量和壽命都被大大降低。最近研究顯示，中國/日本的HD患病率為100萬分之4。目前，已有的療法都只能緩解HD的癥狀，還沒有一款改變HD進程的療法獲得FDA的批準。

與AD類似，HD中引起毒性的異常蛋白質(zhì)特征，開啟了使用CRISPR/Cas9與病毒載體修飾異常蛋白質(zhì)產(chǎn)生的類似策略。

去年1月，來自費城兒童醫(yī)院的Monteys等人的一項研究，通過AAV1載體遞送單側核苷酸多態(tài)性（SNP）依賴的原型間隔區(qū)相鄰基序（PAM）靶向HTT外顯子-1的側翼，將Cas9蛋白連接至突變型HTT（mHTT）等位基因，同時避免影響正常的等位基因。結果表明，這種基于SNP指導機制的sgRNA/SpCas9復合物的遞送有效地將HD小鼠的HTT表達降低高達40％。

去年6月，埃默里大學（美國亞特蘭大）的一組研究表明，利用AAV病毒載體遞送CRISPR/Cas9介導的失活，誘導小鼠內(nèi)源性mHTT表達的永久性抑制?？茖W家們注意到，幾周后，亨廷頓小鼠模型原本聚集在腦內(nèi)的毒性蛋白質(zhì)幾乎完全消失了。更令人驚訝的是，盡管沒有達到對照小鼠的水平，但小鼠的運動能力的確有所改善。這為神經(jīng)退行性疾病的研究開辟了一條全新道路，研究人員表示希望能夠盡開展人體試驗。

今年2月，來自波蘭生物有機化學研究所的研究人員在HD患者的細胞模型中測試了一種新的Cas9蛋白變體，該版本的Cas9能切割一條DNA鏈，而不是兩條DNA，這增加了Cas9可以編輯特定DNA序列的精確度。他們使用該版本的Cas9切除重復DNA序列，從而促使引起亨廷頓氏病的基因失活，并終止毒性蛋白質(zhì)的合成，并且沒有觀察到序列特異性的副作用。

肌萎縮側索硬化（ALS）

肌萎縮側索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）即為大家所知的漸凍人癥，也是導致霍金在輪椅上度過晚年的疾病。這是一種慢性進行性運動神經(jīng)元退化性疾病，占運動神經(jīng)元病的80%，隨著疾病進展患者會出現(xiàn)嚴重的肌肉萎縮，癱瘓甚至因呼吸衰竭而死亡，一般無認知、智能和感覺障礙。

在美國，ALS的患病率約為10萬分之5，中國尚無確切的流行病學資料。ALS有家族性和散發(fā)性兩種類型，患者多為男性，多數(shù)患者發(fā)病年齡為50~70歲。

目前還沒有用于ALS根治性的藥物，它的致病機制尚不清楚。ALS屬于神經(jīng)退行性疾病，此類疾病都有一個共同特征——異常蛋白質(zhì)團塊在大腦中積累。在ALS中，這些蛋白質(zhì)團塊或聚合物被認為對神經(jīng)元具有致命毒性，最終導致毀滅性的疾病癥狀。

ALS的某些形式（約20％的遺傳形式）是由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突變引起的，這種基因通常有助于保護細胞免受有毒自由基的侵害，這為CRISPR/Cas9作為ALS的前瞻性治療手段取得了進展。

強有力的概念證明是發(fā)表于2017年末的一項研究，來自加州大學伯克利分校的研究人員使用Cas9切除編碼SOD1蛋白的基因，并利用工程化的AAV載體穿透脊髓靶向運動神經(jīng)元細胞核。

與未治療的大鼠相比，經(jīng)過治療的大鼠的運動神經(jīng)元保留率提高了約50％，疾病發(fā)作延遲了37％，生存機會增加了約25％，同時，突變SOD1蛋白的產(chǎn)生減少了2.5倍。目前，作者正在推進工程化AAV的設計，以進一步針對ALS模型中運動神經(jīng)元周圍的有害細胞。

另一項研究來自河北醫(yī)科大學，研究人員向SOD1基因突變的ALS小鼠肌肉注射編碼人類胰島素樣生長因子1（hIGF1）的自身互補腺相關病毒載體9（scAAV9），結果發(fā)現(xiàn)scAAV9-hIGF1促使ALS小鼠脊髓運動神經(jīng)元丟失的顯著減少以及ALS疾病發(fā)作的延遲，從而整體壽命延長。

隨后，研究人員使用針對CNS的IGF1敲低的CRISPR/Cas9系統(tǒng)進一步驗證，結果使D-氨基酸氧化酶（DAO）降低，D-氨基酸氧化酶控制D-絲氨酸水平，D-絲氨酸水平與ALS相關。這種形式的神經(jīng)營養(yǎng)因子基因治療具有極高潛力，因為目前FDA批準的唯一一種ALS治療方法是利魯唑，據(jù)報道，利魯唑僅發(fā)揮適度的神經(jīng)保護作用，僅僅幾個月就能提高生存率。

病毒感染引起的神經(jīng)變性

除了一些我們熟知的神經(jīng)退行性疾病以外，最新的臨床前實驗還顯示，CRISPR/Cas9的治療作用還延伸到改善由病毒感染引起的神經(jīng)變性。

丨約翰坎寧安病毒（JCV）

約翰坎寧安病毒（JCV）的致病作用被稱為進行性多灶性白質(zhì)腦病（PML），這是CNS中可能致命的脫髓鞘疾病。JCV作為DNA病毒的性質(zhì)使其可成為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的主要靶標。

丨人類免疫缺陷病毒（HIV）

HIV感染導致免疫失調(diào)與自身免疫激活相結合，導致與腦病誘導相關的神經(jīng)認知障礙，這種病毒引起的主要神經(jīng)系統(tǒng)疾病是NeuroAIDS。長期感染艾滋病病毒已經(jīng)證明可以誘導顯著的神經(jīng)元丟失，并在一定程度上導致神經(jīng)變性。

由于HIV是一種逆轉錄病毒，能整合到宿主細胞基因組中，它可以作為一個持續(xù)的原始病毒庫來重新激活，導致該疾病通常是無法治愈的。但HIV的DNA前病毒復制中間體允許使用CRISPR/Cas9有效靶向系統(tǒng)，故在基因組水平上的根除策略具有治愈潛力。

丨單純皰疹病毒（HSV）

與HIV和JCV相比，靶向HSV缺乏成功的研究，而由于它是一種DNA病毒，很可能響應于基于CRISPR/Cas9的基因治療。此外，研究表明HSV可能是阿爾茲海默癥的病因，這更加激發(fā)起了人們對此新型治療手段的興趣。

結語

CRISPR/Cas9基因編輯工具是基因治療和分子醫(yī)學領域的一個強大的武器庫，應該開展更多的研究，重點關注這種工具在神經(jīng)退行性疾病領域提供的充足潛力。另外，病毒載體結合CRISPR/Cas9基因編輯提高了整體效率，為基因組水平的神經(jīng)疾病的治療提供了令人印象深刻的組合，而向臨床轉化前其安全性還有待進一步的驗證。

隨著病毒載體工程和CRISPR/Cas9基因編輯技術的進步，這種結合形式的治療手段有望發(fā)揮強大的治療潛力。