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分子生物學(xué)的一個(gè)基本技術(shù)是,從一個(gè)文庫(kù)的復(fù)雜DNA混合物中分離出一個(gè)稀有的克隆。從一個(gè)高度復(fù)雜的文庫(kù)中分離cDNA或基因組克隆,通常是研究基礎(chǔ)生物學(xué)過(guò)程以及進(jìn)行應(yīng)用生物學(xué)研究的第一步。對(duì)于一個(gè)2×109bp的單倍體生物基因組、平均插入大小為20000bp的典型基因組文庫(kù)來(lái)說(shuō),一個(gè)單拷貝基因的出現(xiàn)概率大約為1/105。與之類(lèi)似,對(duì)于一個(gè)衍生于表達(dá)許多不同基因的組織或細(xì)胞系、高度復(fù)雜的cDNA文庫(kù)來(lái)說(shuō),一個(gè)特定克隆出現(xiàn)的概率也是很低的。要得到一個(gè)目標(biāo)克隆,必須篩選大量的克隆,因此用膜雜交的方法( Benton and Davis1977)或表達(dá)克隆法( Wong et al.1985)篩選一個(gè)高度復(fù)雜的文庫(kù),將是一項(xiàng)非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。
PCR能夠以很大的數(shù)量級(jí)來(lái)擴(kuò)增特定的核苷酸序列( Saiki et al.1985)。當(dāng)篩選個(gè)高度復(fù)雜的噬菌體或質(zhì)粒載體DNA文庫(kù)時(shí),PCR可以通過(guò)增加一個(gè)特定序列的豐富度,從復(fù)雜的分子克隆混合物中得到一個(gè)稀有的DNA序列,因而可以容易地從一個(gè)文庫(kù)中鑒別出一個(gè)特定的克隆。這可以通過(guò)把原始的文庫(kù)分為復(fù)雜度降低的亞庫(kù),再在每個(gè)亞庫(kù)或亞庫(kù)的組合中篩選特定的DNA序列來(lái)實(shí)現(xiàn)(圖24-1)。含有目的克隆的亞庫(kù)再進(jìn)一步細(xì)分為更小的庫(kù),再對(duì)每一個(gè)小庫(kù)使用同樣的PCR程序篩選。幾輪劃分和篩選之后,原來(lái)稀有的克隆就大大地富集了,因而可以容易地得到純的克隆( Israel1993)。
本章介紹了用PCR篩選高度復(fù)雜的DNA文庫(kù)的方法。這種方法可以在短時(shí)間內(nèi)篩選個(gè)高度復(fù)雜的文庫(kù),并且提供了另外一種選擇來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的那種費(fèi)時(shí)的、需要噬菌斑或菌落雜交,或者說(shuō)需要功能基因表達(dá)產(chǎn)物的方法。這種篩選技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于它的速度、靈敏度和簡(jiǎn)易性。一些分子生物學(xué)試劑的供應(yīng)商,如 MrC geneservice公司,可以提供直接用于PCR篩選的文庫(kù)。另外,本章所描述的方法需要不止一個(gè)能與模板DNA和/或PCR產(chǎn)物正確退火的寡核苷酸,因而增加了真陽(yáng)性信號(hào)的嚴(yán)謹(jǐn)度。
要設(shè)計(jì)特異和高效的PCR引物,需要知道目的基因的精確序列信息。因?yàn)槿祟?lèi)、小鼠和其他幾個(gè)物種的全基因組序列已經(jīng)測(cè)序,這些信息可以用于設(shè)計(jì)很多物種的任何一個(gè)基因的引物。在有些情況下,如用一個(gè)物種的已知序列來(lái)克隆另一個(gè)基因組序列未知的物種的相應(yīng)基因時(shí),目的克隆的確切DNA序列可能是不知道的。在這種情況下,當(dāng)用噬菌斑或菌落雜交法篩選時(shí),通常應(yīng)該使雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性降低,或用簡(jiǎn)并的寡核苷酸探針( Goeddel etal.1980; Toole et al.1984)。進(jìn)行PCR時(shí),由于退火的特異性降低,假陽(yáng)性信號(hào)的出現(xiàn)機(jī)會(huì)增加,因而使用嚴(yán)謹(jǐn)性降低的退火條件,或者使用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物時(shí)會(huì)很困難。另外,因?yàn)镻CR的高度靈敏性,在實(shí)驗(yàn)時(shí)必須非常仔細(xì),以防止樣品的交叉感染產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。然而,如果用于合成引物的序列信息是可靠的,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)操作時(shí)也很小心,這又不失為一種篩庫(kù)成功率非常高的方法
一、材料
注意:標(biāo)記(!)符號(hào)實(shí)驗(yàn)材料的正確操作請(qǐng)參照附錄
1.緩沖液、溶液和試劑
蒸餾水
2酶和酶緩沖液
PCR混合物(可以放在一起冰凍),對(duì)于1m反應(yīng),包括:200nmo的各種dNTP;1×Vent溶液或等價(jià)物;2.5μmol的MgCl2<!>;2nmol的各引物
PCR主要混合物(每個(gè)反應(yīng)必須新鮮配置):1 ul Vent DNA聚合酶或等價(jià)物;991上述PCR混合物
3.核酸和寡核苷酸
2個(gè)PCR引物寡核苷酸
1個(gè)雜交寡核苷酸
PCR正對(duì)照:10ng全基因組DNA或能產(chǎn)生陽(yáng)性PCR信號(hào)的起始文庫(kù)組分(見(jiàn)第⑤步)
4.培養(yǎng)基
LB,1L水中加入:10g蛋白陳、5g酵母抽提物、10 g NaCl,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5〈!>
SM,1L水中加入:5.8gNaC、2 g MgSO4(!)、50ml1mol/ L Tris-HCl〈!)(pH7.5)5ml2%的明膠含10mmol/ L MgSO4的LB
5.特殊設(shè)備
瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備,包括澳化乙錠〈!>
6.其他
96孔板( Corning Costar)
聚酯封口膜( Nalge Nunc International)
噬菌斑雜交所需材料
7.載體和細(xì)菌菌株
用噬菌體載體構(gòu)建的DNA庫(kù)
用于擴(kuò)增文庫(kù)的細(xì)菌菌株〈!
二、方法
在篩選DNA文庫(kù)之前,需要測(cè)定幾個(gè)參數(shù)來(lái)建立有效的實(shí)驗(yàn)條件。這些參數(shù)如下。
①PCR條件。用篩庫(kù)的引物改變退火溫度和循環(huán)次數(shù),以得到最大量的特異產(chǎn)物。模板的來(lái)源可以是將要篩選的文庫(kù)(106個(gè)噬菌體顆粒)或者是10ng的全基因組DNA。在PCR過(guò)程中,噬菌體DNA釋放作為模板。因此,在反應(yīng)之前不需要提純噬菌體DNA?？梢允褂玫牡湫鸵飸?yīng)該產(chǎn)生0.1~1.0kb的產(chǎn)物(16~24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,50%G+C含量)。如果需要(比如,當(dāng)用與不同外顯子配對(duì)、橫跨一個(gè)大的內(nèi)含子的引物時(shí)),目的序列可能比1kb長(zhǎng),但產(chǎn)物的量可能會(huì)減少,
②確定文庫(kù)中基因的豐度。用上面所建立的PCR條件,通過(guò)改變加入噬菌體的數(shù)目定量文庫(kù)。能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的噬菌體的最小數(shù)目就是實(shí)驗(yàn)確定的該基因在文庫(kù)中的豐度。對(duì)于一個(gè)插入片段平均為20kb的基因組文庫(kù)來(lái)說(shuō),要有大于105的復(fù)雜度,以確保目的基因至少出現(xiàn)一次。對(duì)一個(gè)高復(fù)雜度的典型文庫(kù)來(lái)說(shuō),用104~106個(gè)噬菌體做模板,可以顯示基因在庫(kù)中的豐度。加入的含有一個(gè)或兩個(gè)目的基因拷貝的噬菌體的數(shù)目,應(yīng)該用作文庫(kù)篩選。
旦確定了PCR條件和基因的豐度,就可以按照如下方法進(jìn)行文庫(kù)篩選。
D取0.5ml新鮮的、在LB中過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物,與0.5mlSM混合,加入含有文庫(kù)的噬菌體,室溫溫育20min。
②加入20ml含10mmol/ L MgSO4的LB,按8×8矩陣分裝到96孔板中,每孔100l將板用聚酯封口膜密封,37℃225r/min振蕩培養(yǎng)5~6h,對(duì)噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增之后,噬菌體的濃度應(yīng)該增加到大概109個(gè)/ml。
大概有1/3的培養(yǎng)物能被均分進(jìn)96孔板,在計(jì)算步聚①的加入噬菌體數(shù)時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到這一點(diǎn)
③將一排或一列8個(gè)孔中的噬菌體(每孔25μl)用多孔穢液器混合(參看討論部分的可變樣式)。在這一步中,當(dāng)取掉封口膜和移液時(shí),一定要特別小心,以避免樣品交叉污染。如果想避免交叉污染,可以將板子短暫離心,以幫助清除封口膜上的液體。用聚酯封口膜將板子重新封閉,在4℃可以保存1個(gè)月。
④用蒸餾水按1:1稀釋噬菌體,現(xiàn)在噓菌體就可以用作PCR模板了。
⑤在24.5μPCR主要混合物中加入0.5μl的樸板(噓菌體),用上面建立的PCR條件進(jìn)行PCR。每個(gè)實(shí)驗(yàn)需要有一個(gè)負(fù)對(duì)照(不加模板)和一個(gè)正對(duì)照(即能產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的10ng的總基因組DNA或一小份的起始文庫(kù))。
⑥通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。用澳化乙錠染膠并拍照( Sambrook and Rus-sell 2001)
⑦70℃襄空干燥凝膠,變性DNA,然后將寡核苷酸探針(末端用32P標(biāo)記)用標(biāo)準(zhǔn)的DNA雜交條件與干燥的凝膠直接進(jìn)行雜交,洗滌,然后放射性自顯影[這一步的技術(shù)細(xì)節(jié)可以參看 Israel(1993)]。用澳化乙錠染色很容易就能看到特異的PCR產(chǎn)物時(shí),這一步是可以選做的,下面會(huì)有討論。也可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上后再進(jìn)行雜交。
第⑥步和/或第⑦步取得的據(jù)應(yīng)該能鑒定出含有目的基因的亞庫(kù)(見(jiàn)討論部分)。第一輪的篩選現(xiàn)在就完成了,與起始文庫(kù)相比,陽(yáng)性亞庫(kù)中的基因巳經(jīng)被富集了·后續(xù)的篩選循環(huán)是①~⑦步的重復(fù),在擴(kuò)增的亞庫(kù)噬菌體定量之后就可以進(jìn)行。
⑧通過(guò)噬菌斑法確定陽(yáng)性孔中的噬菌體的量( Sambrook and Russell2001)
⑨用約為上一輪數(shù)量1/30的噬菌體侵染細(xì)菌,開(kāi)始下一輪的篩選
⑩重復(fù)②~⑨步
24.1討論
對(duì)于一個(gè)只得到一個(gè)陽(yáng)性克隆的篩選,陽(yáng)性孔應(yīng)該在產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的行和列的交叉處(圖24-1)。對(duì)

于產(chǎn)生兩個(gè)或更多陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)說(shuō),對(duì)產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)的行或列的每個(gè)孔中的噬菌體進(jìn)行第二次PCR,將最終確定陽(yáng)性孔。在下面的部分和圖24-1中將會(huì)討論篩選文庫(kù)的其他方式
根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的量和純度,瓊脂糖凝膠上的結(jié)果將足以鑒定出陽(yáng)性克隆。如果要得到更高的敏感度和特異性,可以按步驟⑦詳述的那樣,用與PCR引物之間的序列特異配對(duì)的放射性或熒光標(biāo)記的探針,與膠上的PCR產(chǎn)物雜交。這一步也可以不做,特別是在篩選的第二階段和第三階段。圖24-2(a)是一個(gè)瓊脂糖凝膠電泳的初步篩選結(jié)果,它是通過(guò)溴化乙錠的染色才觀察到的。因?yàn)镻CR產(chǎn)物非常復(fù)雜,并且特異產(chǎn)物的量很少,需要用雜交來(lái)鑒別陽(yáng)性克隆[圖242(b)]。隨著第二和第三輪篩選,PCR產(chǎn)

在特定的條件下,可以對(duì)該技術(shù)進(jìn)行幾種改進(jìn),使得克隆更加有效,或滿(mǎn)足其他用途的需要。
這些改進(jìn)如下
24.1.1改變壓庫(kù)的合并模式
用8×8矩陣模式合并,只是一種可以使用該技術(shù)的模式。在一個(gè)極端的情況下,可以利用每個(gè)孔的噬菌體分配噬菌體庫(kù)以及做PCR。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)越來(lái)越自動(dòng)化,以及96孔和384孔PCR板及熱循環(huán)儀的產(chǎn)生,噬菌體的擴(kuò)增和PCR都可以用多孔移液器和同樣規(guī)格的板子來(lái)進(jìn)行,這就使得這方法更加可行。但是PCR產(chǎn)物仍然需要用凝膠電泳進(jìn)行分析,如果不用合并策略,個(gè)體樣品的數(shù)目就會(huì)多很多。一個(gè)解決的方法就是,對(duì)擴(kuò)增的噬菌體僅按照一個(gè)方向合并(也即僅按排或列合并)進(jìn)行PCR,然后再對(duì)陽(yáng)性亞庫(kù)每個(gè)孔的噬菌體進(jìn)行第二次PCR。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是分析每個(gè)亞庫(kù)僅需要8個(gè)PCR反應(yīng),分析單個(gè)的孔需要另外8個(gè)PCR反應(yīng),這樣就可以知道陽(yáng)性樣品的精確位置。但是,這種策略需要連續(xù)做兩次PCR,使得整個(gè)過(guò)程需要的時(shí)間增加了。
24.1.2篩選非噬菌體載體上的基因
DNA文庫(kù),尤其是cDNA文庫(kù),通常用的是質(zhì)粒載體。這里所介紹的PCR篩選技術(shù),直用于從一個(gè)質(zhì)粒載體構(gòu)建的文庫(kù)中克隆一個(gè)cDNA基因( Israel1993)。要篩選質(zhì)粒文庫(kù),含質(zhì)粒的細(xì)菌要在多孔板上長(zhǎng)16h,以確保PCR過(guò)程中細(xì)菌的數(shù)目足夠多,在PCR反應(yīng)中可以代表文庫(kù)中的所有克隆。其他的步驟與噬菌體文庫(kù)篩選的步驟是一致的。用YAC載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù),也可以用類(lèi)似的PCR進(jìn)行篩選,只需將YAC進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn),以便在酵母中可以有效擴(kuò)增
24.1.3從載體延伸法
當(dāng)序列信息很有限時(shí),或篩選一個(gè)含有靠近插入?yún)^(qū)一端特定序列的克隆時(shí),其中的一個(gè)引物可以與載體的序列互補(bǔ)( Jansen et al.1989)。由于一個(gè)PCR引物與文庫(kù)中的所有噬菌體退火,這種改進(jìn)將產(chǎn)生大量的不正確的產(chǎn)物。另外,當(dāng)擴(kuò)增的序列長(zhǎng)度大于2kb時(shí),PCR產(chǎn)物的量將會(huì)大大降低。所以,一個(gè)特定克隆在庫(kù)中顯示出的豐度將會(huì)降低。已經(jīng)有了關(guān)于獲得長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的方法( Cheng et al.1994),這就使得該方法更加可行。
本章介紹了篩選高度復(fù)雜的DNA文庫(kù)的基本PCR程序以及幾種改進(jìn)。如果擁有不錯(cuò)的實(shí)驗(yàn)試劑和仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù),這一策略應(yīng)該能穩(wěn)定地篩選到陽(yáng)性結(jié)果。