近年來隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了許多克隆新基因的方法和手段，如圖譜克隆技術(shù)、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、mRNA差異顯示技術(shù)二基因組減法技術(shù)以及cDNA文庫篩選技術(shù)等。但上述方法人多具有實(shí)驗(yàn)周期長、技術(shù)步驟煩瑣且工作量大等特點(diǎn)。cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一種基于PCR從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價(jià)等優(yōu)勢而受到越來越多的重視。
經(jīng)典的RACE技術(shù)是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，主要通過RT-PCR技術(shù)由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5’和3’端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術(shù)提出以來經(jīng)過不斷發(fā)展和完善，克服了早期技術(shù)步驟多、時(shí)間長、特異性差的缺點(diǎn)(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等11999)。對(duì)傳統(tǒng)RACE技術(shù)的改進(jìn)主要是引物設(shè)計(jì)及RT-PCR技術(shù)的改進(jìn):改進(jìn)之一是利用鎖定引物((lock docking primer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入兩個(gè)簡并的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始點(diǎn)，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時(shí)oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結(jié)合所帶來的影響;改進(jìn)之二是在5‘端加尾時(shí)，采用poly(C)，而不是poly(A);改進(jìn)之三是采用RNase H一莫洛尼氏鼠白血.病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫h (60 度 -70度 )有效地逆轉(zhuǎn)錄mRNA，從而消除了5‘端由于高CC含量導(dǎo)致的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的影響;改進(jìn)之四是采用熱啟動(dòng)PCR (hot start PCR)技術(shù)和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反應(yīng)的特異性。
隨著RACE技術(shù)日益完善，目前己有商業(yè)化RACE技術(shù)產(chǎn)品推出，如CLONTECH的MarathoTM技術(shù)和SMART TM RACE技術(shù)術(shù)。邢桂春等(2001)先后使用上述兩種試劑盒進(jìn)行RACE反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用Marathon TM所得到的片斷總是比采用SMARTsup]TMRACE試劑盒到所得到的片斷短。其原因在于Marathon TM技術(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)往往不能真正達(dá)到mRNA的5’末端。所以認(rèn)為，進(jìn)行RACE反應(yīng)應(yīng)當(dāng)優(yōu)選SMARTTM RACE試劑盒。以下就國內(nèi)目前應(yīng)用最廣的SMART TM RACE試劑盒為例，簡要概述RACE技術(shù)的原理和操作過程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是:利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。然后用一個(gè)基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3‘末端的。DNA片段擴(kuò)增出來。見figure 1
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SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以O(shè)ligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉(zhuǎn)錄酶MMLV作用下，反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。利用該反轉(zhuǎn)錄酶具有的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在反轉(zhuǎn)錄達(dá)到第一鏈的5‘末端時(shí)自動(dòng)加上3一5個(gè)(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對(duì)后，轉(zhuǎn)換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(figure 2 )。然后用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為上游引物，用一個(gè)基因特異引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因5‘末端的cDNA片段擴(kuò)增出來。最終，從2個(gè)有相互重疊序列的3' / 5‘-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物的3‘和5‘端序列，合成相應(yīng)引物擴(kuò)增出全長cDNA。
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我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，要做好RACE反應(yīng)實(shí)驗(yàn)不容易，實(shí)際操作中仍存在不少困難。因此，對(duì)RACE反應(yīng)條件進(jìn)行反復(fù)摸索是實(shí)驗(yàn)必須要做地。這是因?yàn)?第一，在5‘-RACE包含了有3個(gè)連續(xù)的酶反應(yīng)步驟(反轉(zhuǎn)錄、同聚物加尾和PC R擴(kuò)增)，每一步都可能導(dǎo)致失敗;第二，擴(kuò)增。DNA末端的特異性完全依賴錨定引物及擴(kuò)增DNA模板樣品不均一性，因而特異性一般很低，常呈現(xiàn)不清晰的成片條帶或截短的產(chǎn)物背景。因此，使用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的特異末端片段，所獲得的重組克隆最好能夠全部測序，以排除RACE實(shí)驗(yàn)結(jié)果中擴(kuò)增產(chǎn)物假陽性和假陰性，最終有可能獲得新基因的全序列。我們相信，
隨著RACE的不斷改進(jìn)和完善，優(yōu)化條件下PCR擴(kuò)增效率和忠實(shí)性的提高及PCR產(chǎn)物克隆技術(shù)的迅速發(fā)展，RACE必將在基因克隆及基因表達(dá)研究中發(fā)揮越來越大的作用。
下面簡單介紹一下RACE的另一種代表方法——Self-Ligation法
步驟：
1. 反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)。
2. Hybrid RNA的分解。
3. 單鏈cDNA的自身連接。
4. PCR擴(kuò)增5’未知區(qū)域。
5. 目的DNA片段的切膠回收。
6. DNA序列測定。
原理見figure 3
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下面我把兩種kit的說明書傳到館藏文獻(xiàn)，望需要的戰(zhàn)友去下載（注意7月4日后將刪除）。
BD clontech SMART RACE PCRkit：
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自頂一下，歡迎作RACE的戰(zhàn)友參加討論！
請問你有沒有用過invitrigen公司的GeneRace，我下周就要做5’ RACE了?？催^說明書了，但有點(diǎn)擔(dān)心，因?yàn)樽鞑怀鰜淼脑捑蜔o法作重組了。
抱歉，我沒有，我用的是BD clontech Co的，到時(shí)有問題我們可以討論。
我沒有看過invitrogen Co的，能否傳一份protocol，email：yshu3507@126.com
感謝yshu3507戰(zhàn)友的專題講座！
希望對(duì)RACE有興趣的朋友積極參加討論！對(duì)有意義的回帖加分從優(yōu)！
本專題將置頂1個(gè)月！
invitrogen公司5’RACE的簡介：傳統(tǒng)的RACE會(huì)得到多個(gè)PCR結(jié)果，因?yàn)槠渌褂玫腸DNA來源于斷裂及全長mRNA。研究人員必須鑒定每一個(gè) PCR 產(chǎn)物以獲得帶有全長5′末端序列的產(chǎn)物。GeneRacer™ 只針對(duì)全長的5′加帽mRNA，從而節(jié)省了花費(fèi)在篩選大量PCR產(chǎn)物上的時(shí)間。示意圖簡介了GeneRacerTM 的工作原理。RNA樣品經(jīng)CIP（小牛腸堿性磷酸酶）和TAP（煙草酸焦磷酸酶）處理，保證GeneRacer™ 寡聚RNA僅同全長轉(zhuǎn)錄本連接。然后使用SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA做為PCR的模板。GeneRacer™ 寡聚RNA序列做為GeneRacerTM 5′引物結(jié)合位點(diǎn)，這樣，只有具有全長5′末端的cDNA才會(huì)被擴(kuò)增。使用GeneRacer步驟及高保真度Platinum® Taq DNA聚合酶，就可以確保得到最高效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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還想請教一下你對(duì)race后dna擴(kuò)增的看法（race直接產(chǎn)物量少，不易測序）。我認(rèn)為巢式pcr法不好，因?yàn)榫退阌玫氖歉弑Ｕ鎡ag酶，錯(cuò)配率還是很高的，會(huì)影響測序結(jié)果。我覺得連接到質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化細(xì)菌，再在細(xì)菌內(nèi)擴(kuò)增后再測序比較好，因?yàn)榧?xì)菌內(nèi)dna聚合酶有校讀功能。
你說的很好，我們做的方法是，先分開擴(kuò)兩端，測序后，從兩端設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)全長，這樣用高保真tag酶，就像我們平時(shí)擴(kuò)已知序列那樣輕松了。
我收集的一些資料：希望對(duì)做race的戰(zhàn)友有用。
invitrogen公司5’RACE的方法為寡核苷酸帽法(Oligo caping method)，該方法由日本東京大學(xué)鈴木等開發(fā)。其特點(diǎn)為大規(guī)模、高通量、高精確度。
1. 傳統(tǒng)的cDNA克隆化技術(shù)的缺點(diǎn)：理想的克隆cDNA應(yīng)包含模板mRNA的5'帽的結(jié)構(gòu)以及3'多聚A尾的全長序列。 然而，傳統(tǒng)的方法克隆的cDNA，多數(shù)情況下其5'末端為部分缺失狀態(tài)。究其原因有二：一是在以mRNA模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，逆轉(zhuǎn)錄酶在從模板mRNA中逆轉(zhuǎn)錄酶脫落，只能得到部分拷貝的cDNA產(chǎn)物；二是在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄過程中，用了部分5'末端被降解的mRNA為模板合成cDNA，因此在構(gòu)建cDNA文庫中得到的多數(shù)是5'末端部分缺失狀態(tài)的cDNA。換言之，在構(gòu)建cDNA文庫的過程中，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶以及應(yīng)用極易受降解的mRNA是不可避免的，因此5'末端部分缺失就不足為奇了。
2.全長cDNA的克?。簽榱藰?gòu)建含全長的cDNA 文庫，就有必要從含有多數(shù)為非全長的cDNA文庫中挑選出全長cDNA的一個(gè)過程。如果我們有辦法識(shí)別全長cDNA的5'端和3'端，就有可能挑選出全長cDNA。 mRNA的3'端中有一個(gè)多聚 A尾結(jié)構(gòu)可作為明確的識(shí)別標(biāo)記。事實(shí)上、傳統(tǒng)的cDNA文庫的構(gòu)建過程，也正是利用了 mRNA 3'端這一特征性的標(biāo)簽（tag），用多聚T引物合成cDNA的第一鏈而構(gòu)建的。在mRNA的5'端存在一個(gè)帽結(jié)構(gòu)，而自然狀態(tài)下的這一結(jié)構(gòu)不能象3'端的多聚 A尾一樣，直接作為一個(gè)識(shí)別標(biāo)記。由此可以設(shè)想，把這一結(jié)構(gòu)用某種序列來替換，使其變成一個(gè)象多聚 A尾一樣的特征性的序列標(biāo)簽（sequence tag），就有可能作為一個(gè)識(shí)別標(biāo)記，這就是寡核苷酸帽法作為 5'端的識(shí)別標(biāo)記的思路。
3. 全長cDNA文庫的構(gòu)建：為了克服傳統(tǒng)的方法構(gòu)建cDNA文庫中所存在的缺點(diǎn)，鈴木等開發(fā)了用特征性的序列標(biāo)簽替換mRNA5'端的帽的新方法—寡核苷酸帽法(Oligo caping method)。這一方法所獲得的mRNA 5'端有RNA寡核苷，3'端有多聚 A尾特征性，因此其兩端均有特征性的序列標(biāo)簽作為識(shí)別標(biāo)記，我們就可能構(gòu)建只含有全長cDNA的文庫。
4．本技術(shù)的意義：確定啟動(dòng)子區(qū)域精確的確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?；虻膯?dòng)子區(qū)域中含有許多重要的調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列（順式元件），若要闡明基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制，克隆啟動(dòng)子序列是必不可缺的關(guān)鍵一環(huán)。到目前為止，已闡明啟動(dòng)子序列以及它們的調(diào)控機(jī)制的基因數(shù)量非常有限。事實(shí)上，標(biāo)準(zhǔn)的真核生物有關(guān)的啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫Eukaryotic Promoter Database中登錄的基因啟動(dòng)子也不過數(shù)百個(gè)而已。這其中一個(gè)重要原因之一是許多基因未能確切的確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。S1核酸酶作圖法、引物延伸法、5'RACE法等傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的確定方法，技術(shù)要求比較高，且有時(shí)由于種種原因，難以確定確切的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。而利用鈴木等開發(fā)的寡核苷酸帽法構(gòu)建的cDNA文庫中，隨機(jī)的克隆全長的cDNA，適合于大規(guī)模、精確的獲得基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的信息。
yshu3507 wrote:
你說的很好，我們做的方法是，先分開擴(kuò)兩端，測序后，從兩端設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)全長，這樣用高保真tag酶，就像我們平時(shí)擴(kuò)已知序列那樣輕松了。
請問yshu3507戰(zhàn)友，“先分開擴(kuò)兩端，測序”，race產(chǎn)物的量一般很少，直接測序夠嗎？
分開擴(kuò)兩端,也要先亞克隆，一般不推薦直接用產(chǎn)物測序，因?yàn)樵跍y序的時(shí)候，兩端50bp左右的信號(hào)不會(huì)太強(qiáng)，也就是測不準(zhǔn)確，這樣會(huì)影響你下一步設(shè)計(jì)引物擴(kuò)全長。
多謝。明天我準(zhǔn)備做對(duì)照實(shí)驗(yàn)了，有問題再請教您！
可惜2周前我的硬盤壞了，上面有好多我收集來的有關(guān)RACE及RNAi的資料，現(xiàn)在由得再找了。
很高興有了這么一個(gè)RACE專題，我以前好像提議了，但是沒有人響應(yīng)呵呵，不過現(xiàn)在好了，借機(jī)會(huì)問個(gè)問題：
1 我用的是clontech的race kit
2 一對(duì)基因特異引物可以擴(kuò)出目的片斷（測序驗(yàn)證過）
3 可是用這對(duì)GSP分別做3‘5’RACE時(shí)，做了好多的克隆都沒有拿到任何結(jié)果（即使是大家公認(rèn)的好作的3‘端）
4 我根據(jù)擴(kuò)出的中間片段設(shè)計(jì)另外的GSP（兩對(duì)），同樣沒有拿到任何結(jié)果，克隆做了好多
5 用第一對(duì)GSP的3’5‘RACE產(chǎn)物做模板，再用4中的GSP做nest－pcr仍然沒有拿到要的東西
這種情況，大家認(rèn)為應(yīng)該如何往下做，該作些什么，謝謝
我們的做法是：如果RCR產(chǎn)物不是很特異或沒有目的條帶的話，建議用nest PCR。在做5‘時(shí)，對(duì)RNA要求比較高，最好用新鮮的組織提，隨即做逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增。
做RACE PCR條帶單一的不多，盡可能的回收與目的片段大小相近的條帶。克隆的時(shí)候，一般kit上建議挑8-10個(gè)克隆，多一個(gè)，多一份希望，因?yàn)镽ACE，尤其是5’太難了，我作了約6個(gè)月。
yshu3507 wrote:6個(gè)月!嚇?biāo)牢伊恕Ｎ覝?zhǔn)備做2個(gè)月，看來希望渺茫啊。
因?yàn)镽ACE，尤其是5’太難了，我作了約6個(gè)月。
^_^，如果您順的話，一個(gè)禮拜足矣！
我的怎么做不出來？我做3'RACE的方法與上面說的Smart RACE一樣，只是我的RNA是經(jīng)poly A polymerase 加A后得到的mRNA.但是作不出來，有沒有人做過類似的實(shí)驗(yàn)。請給我一點(diǎn)建議啊。郁悶中?。?
能不能把你的具體步驟貼出來,讓大家都來給你分析一下問題可能出在哪兒.
yshu3507 wrote:
^_^，如果您順的話，一個(gè)禮拜足矣！
同意，5'-RACE確實(shí)比較難，但也有順利的時(shí)候，我上周做5'-RACE也一次就成功了，我覺得關(guān)鍵還是RNA 的質(zhì)量，如果RNA模板質(zhì)量不好，后面做得再認(rèn)真也是白費(fèi)！
同時(shí)現(xiàn)在可以通過seegene公司的DNA Walking SpeedUp⑩ Kit 快速得到未知的序列，要比5'-RACE容易一些，Kit的簡介如下：
Introduction：As a third commercial application of Seegene's proprietary ACP (Annealing Control Primer) Technology maximizing PCR specificity, the DNA Walking SpeedUp⑩ Kit is directed to methods of using our unique DNA Walking ACP (DW-ACP) primer which is designed to capture unknown target sites and the optimized PCR conditions (referred to as DW ACP-PCR⑩ Technology hereunder). Due to the unique features of the DW-ACP primer system, DW ACP-PCR⑩ Technology enables the researchers to obtain only genuine unknown target products up to the length (up to 2 Kb) of which Taq polymerase is able to synthesize. This method provides the most powerful and revolutionary way to directly amplify unknown sequences adjacent to known sequences (Fig. 1). Whole genomic DNA, total RNA, cDNA or plasmid (clone) can be used as starting material.
The kit provides four different DW-ACP 1, 2, 3, 4 each having "GGTC" sequence at 3'
end which is present in every 1-2 kb template on average. To extend this, unknown
target sequences can be amplified using DW-ACPs and TSPs (Target Specific Primers).
具體的原理和方法見以下的網(wǎng)頁：
>
看了一下，發(fā)現(xiàn)這種方法并不一定好。
1.Gene-Specific Linear Amplification of Second Strand cDNA,這一步為單引物PCR，隨后用5‘端帶一部分已知序列的N10隨機(jī)引物進(jìn)行延伸，因?yàn)槭请S機(jī)引物，故究竟能夠延伸多長的未知區(qū)域就無從知道，后面即使采用多輪巢式PCR，我看也不一定能夠得到單一條帶，所以后面的工作量相當(dāng)大，而且不一定有可靠的結(jié)果，萬一提總RNA時(shí)碰上基因組污染就更麻煩了！
2.形成套索結(jié)構(gòu)的難度較大，此步類似TaKaRa 5’ RACE Kit中利用5‘-P化引物進(jìn)行自身環(huán)化，感覺還沒有TaKaRa 5’ RACE Kit簡潔，操作相當(dāng)煩瑣！
See-gene公司雖然已經(jīng)推出了基于此法的替代RACE試劑盒，但我覺得該技術(shù)并不一定能夠普及適用，為廣大用戶所接受！
希望有DX指正！
謝謝 immuno05 戰(zhàn)友的高見，但老兄可能沒有仔細(xì)看，seegene公司的DNA Walking SpeedUp⑩ Kit 和Universal Fast Walking (UFW) 還是有一定的區(qū)別，seegene公司的DNA Walking SpeedUp⑩ Kit 可以用DNA或者cDNA作為模板擴(kuò)增基因的序列，據(jù)我所知它目前已經(jīng)廣泛被廣泛使用，所以immuno05 兄的擔(dān)心可能是多余的！
我用的是這個(gè)公司的試劑盒用了好幾次都沒有出現(xiàn)預(yù)期的條帶，總是非特異的帶，不是大了就是小了，我想向用過這個(gè)試劑盒的高手請教，想知道操作中及使用中的注意事項(xiàng)。特別是哪個(gè)試劑盒提供的反轉(zhuǎn)錄溫度為42~55度，我想知道我究竟用哪個(gè)溫度反轉(zhuǎn)比較好呢，都做了很久了一直都沒有結(jié)果，很是著急啊，眼看要畢業(yè)了！懇請各位大蝦知道！
qq 147610423
hanxgan@tom.com
好貼，已收藏。：）
hanxgan wrote:
我用的是這個(gè)公司的試劑盒用了好幾次都沒有出現(xiàn)預(yù)期的條帶，總是非特異的帶，不是大了就是小了，我想向用過這個(gè)試劑盒的高手請教，想知道操作中及使用中的注意事項(xiàng)。特別是哪個(gè)試劑盒提供的反轉(zhuǎn)錄溫度為42~55度，我想知道我究竟用哪個(gè)溫度反轉(zhuǎn)比較好呢，都做了很久了一直都沒有結(jié)果，很是著急啊，眼看要畢業(yè)了！懇請各位大蝦知道！
qq 147610423
hanxgan@tom.com
從mRNA擴(kuò)增其UTR區(qū)，RT時(shí)的溫度主要取決于你的Target Specific Primer的Tm,通常比預(yù)測的Tm低3-5度，當(dāng)然，還要考慮逆轉(zhuǎn)錄酶的最適溫度，譬如普通MMLV逆轉(zhuǎn)錄在不加一些巖藻糖等一些高溫穩(wěn)定劑時(shí)就不能用45度甚至更高的溫度。
seegene公司的DNA Walking SpeedUp⑩ Kit 是根據(jù)一個(gè)韓國人的技術(shù)而開發(fā)成的，由于其原理上的固有缺陷，并不能完整擴(kuò)增一個(gè)cDNA的5‘或3’端的未知區(qū)域。它先用一種類似于隨機(jī)引物的Annealing control primer/DW-ACP的3‘端的序列來隨機(jī)引發(fā)，進(jìn)而通過幾輪nested-PCR來擴(kuò)增出一部分未知區(qū)域，請結(jié)合下面的原理圖，這種方法是不可能P出全部的未知區(qū)域的！
注意：該技術(shù)的獨(dú)特之處就在于它的DW-ACP引物，其5’為一段設(shè)計(jì)獨(dú)特的專用于后面nested-PCR的序列，3‘端的幾個(gè)堿基序列類似于一種隨機(jī)序列，通過連接5‘端與3’端之間的一段poly( I )5來調(diào)節(jié)3‘端序列的隨機(jī)引發(fā)位點(diǎn)，我認(rèn)為，將該方法用于RACE，是不可能得到全部長度的的UTR區(qū)的。
就5’-RACE而言，我認(rèn)為目前最理想還是SMART-RACE試劑盒，當(dāng)然，價(jià)錢也是最貴的，就費(fèi)效比而言，我覺得TaKaRa的基于IPCR的5‘-RACE試劑盒還是不錯(cuò)的！
（縮略圖，點(diǎn)擊圖片鏈接看原圖）
那位前輩有結(jié)合3’RACE 與5’RACE原理構(gòu)建全長cDNA 文庫的經(jīng)驗(yàn)，或有相關(guān)資料請回復(fù)幫幫后生，在此感激不盡。
我們準(zhǔn)備構(gòu)建一種動(dòng)物組織的全長文庫，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路如下：
組織——提取總RNA——反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一條鏈（反轉(zhuǎn)錄引物含有接頭引物,有酶切位點(diǎn)）——RNase A & RNase H消化雜合cDNA 中ＲＮＡ——TdTase加尾(dCTP 加tail c)——高保真Ｔap酶ＰＣＲ擴(kuò)增得到全長雙鏈cDNA （Ｐ１：針對(duì)反轉(zhuǎn)錄引物中的接頭引物設(shè)計(jì)；Ｐ２：針對(duì)加dtail 設(shè)計(jì)，含接頭引物及８個(gè)Ｇ）——ＰＣＲ產(chǎn)物與Ｔ－vector連接——轉(zhuǎn)化得文庫
我們實(shí)驗(yàn)中遇到的難點(diǎn)如下：
１高保真Ｔap酶ＰＣＲ擴(kuò)增得到全長雙鏈cDNA ，ＰＣＲ產(chǎn)物電泳理想情況下圖譜應(yīng)有什么特點(diǎn)？
２這種ＰＣＲ產(chǎn)物我們電泳得到約２００bp～３０kb的拖尾條帶，但經(jīng)ＰＣＲ產(chǎn)物純化試劑盒純化，再用乙醇沉淀，用雙蒸水溶解沉淀以濃縮，電泳鑒定這種濃縮ＰＣＲ產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)有大量（約９０％）的ＤＮＡ跑不出加樣孔，該如何解釋？
３這種ＰＣＲ產(chǎn)物與Ｔ－vector連接，連接效率極低，都有那些因素會(huì)照成，怎樣去避免？
懇請高手明鑒，或幫助收集相關(guān)資料給予回復(fù)！
謝謝各位大蝦。我正打算做呢。
本人又將第二次PCR的產(chǎn)物跑了一次電泳，還是跑不出孔,不知道是怎么回事
我用的是TaKaRa的RACE試劑盒,
望各位頂力相住,
急!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
