景杰生物/報(bào)道

編者按

苯甲酸鈉是常見的食品添加劑，在蜜餞、果干、汽水中廣泛使用。此外苯甲酸鈉也是FDA批準(zhǔn)的藥物，用于治療尿素循環(huán)紊亂導(dǎo)致的高血氨癥。雖然苯甲酸鈉被認(rèn)為是相當(dāng)安全的食品添加劑，但是近期也有其對(duì)健康不利的報(bào)道。同時(shí)，日本現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)苯甲酸鈉的使用作出限制，但是對(duì)于苯甲酸鈉影響健康的分子機(jī)制還未知。

近日，芝加哥大學(xué)趙英明教授課題組在國際著名期刊Nature Communication上發(fā)表了題為“Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2”的論文，報(bào)道了迄今唯一的發(fā)生在組蛋白賴氨酸上，含有苯環(huán)的?；揎?---苯甲酰化修飾（圖1），為蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究開辟新的領(lǐng)域，也為評(píng)價(jià)目前食品添加劑的安全性提供了新思路。趙英明教授課題組的黃河博士為文章的第一作者，參與本研究的還有香港大學(xué)的郝權(quán)教授、喬治亞大學(xué)Y. George Zhen教授。

圖1. 苯甲?；c乙?；谋容^

研究小結(jié)

苯甲酸鈉是被廣泛使用的食品添加劑，F(xiàn)DA允許在食品中不高于0.1%的添加量，同時(shí)苯甲酸鈉也被作為治療高血氨癥的藥物。有報(bào)道指出，攝入苯甲酸鈉可能會(huì)對(duì)人的健康產(chǎn)生傷害，用于治療目的的苯甲酸鈉若劑量不合適也會(huì)導(dǎo)致健康問題，但是對(duì)于苯甲酸鈉影響人類健康的分子機(jī)制的研究并不明朗。

近日趙英明教授發(fā)現(xiàn)了發(fā)生在賴氨酸上的新型修飾-----苯甲?；揎棧\(yùn)用生物質(zhì)譜與生物化學(xué)的方法鑒定出位于組蛋白的22個(gè)賴氨酸可發(fā)生苯甲?；揎?，該種修飾會(huì)受到苯甲酸鈉的激發(fā)，并受到SIRT2的調(diào)節(jié)。CHIP-Seq和RNA-Seq數(shù)據(jù)揭示出苯甲酰修飾主要集中在基因的啟動(dòng)子上，且其生理功能與乙?；⒎峭耆嗤瑫?huì)通過影響基因表達(dá)水平調(diào)控響應(yīng)的通路。

研究思路和成果

1. 組蛋白上賴氨酸苯甲酰化修飾的鑒定和驗(yàn)證

作者提取了HepG2細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行胰蛋白酶酶解后，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，得到質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖2上）后，利用趙英明教授搭建的曾為無數(shù)翻譯后修飾的發(fā)現(xiàn)立下汗馬功勞的PTMap（Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Jan 20;106(3):761-6.）分析數(shù)據(jù)，在H2B的第五位賴氨酸上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)104.0268道爾頓的質(zhì)量偏移，并通過人工合成肽段，比較HPLC的保留時(shí)間和質(zhì)譜譜圖，確定這個(gè)質(zhì)量偏移是由一個(gè)苯甲?；鸬?。

 圖2. （上）H2B第五位賴氨酸苯甲酰化的質(zhì)譜鑒定及

（下）苯甲?；嚎贵w的質(zhì)控

為了更好的研究苯甲酰化修飾，作者利用杭州景杰開發(fā)針對(duì)苯甲?；揎椀姆嚎贵w進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示，該抗體可以非常靈敏的檢測到苯甲?；揎棧粫?huì)對(duì)賴氨酸上的其他種類的修飾產(chǎn)生非特異性結(jié)合（圖2下）。

2. 苯甲酰化位點(diǎn)的鑒定

后續(xù)的研究中，通過檢測5mM苯甲酸鈉處理的細(xì)胞與對(duì)照組的差異，作者鑒定到了共計(jì)22個(gè)組蛋白的苯甲酰化修飾位點(diǎn)（圖3）。令人振奮的是，幾乎所有的苯甲?；揎椢稽c(diǎn)都集中在組蛋白的N末端區(qū)域的賴氨酸側(cè)鏈，這與廣泛分布在組蛋白的賴氨酸的乙?；投辊；a(chǎn)生了強(qiáng)烈對(duì)比，暗示了苯甲?；谌旧|(zhì)的調(diào)控中可能扮演了與眾不同的重要角色。

圖3. 組蛋白上的苯甲?；稽c(diǎn)分布

3. 苯甲酸鈉刺激條件下苯甲?；揎椀膭?dòng)態(tài)調(diào)控

利用同位素氘標(biāo)記的方法，作者確認(rèn)了苯甲酸鈉確實(shí)可以刺激細(xì)胞中苯甲酰化的發(fā)生，而同時(shí)細(xì)胞的乙酰化水平僅僅略有降低（圖4）。作者同時(shí)指出，一些位點(diǎn)的苯甲酰化水平與乙?；较喈?dāng)，顯示出在暴露在富含苯甲酸鈉的環(huán)境中，苯甲?；陌l(fā)生是非常普遍的。

圖4. 苯甲酰化水平受到苯甲酸鈉濃度低影響

4. SITR2可以在體內(nèi)體外去除苯甲?；揎?/strong>

HDAC，組蛋白去乙?；甘且活惪梢詫⒁阴；鶊F(tuán)從組蛋白上移除的一類酶。其中一種HDAC，SIRT2被鑒定出具有明顯的去苯甲?；富钚裕▓D5左上），并且催化過程依賴于NAD+，且可以被第三類HDAC抑制劑（例如NAM）抑制其催化活性，而不受TSA的影響（圖5右上）。作者還進(jìn)一步比較了SIRT2的去乙?；腿ケ郊柞；富钚缘膮^(qū)別（圖5下）。

圖5. SIRT2依賴于NAD+的去苯甲?；揎椕富钚?/span>

5. 苯甲酰化修飾的全基因組分布

為了研究組蛋白苯甲?；揎椩谌蚪M的分布情況，作者在苯甲酸鈉處理后的細(xì)胞中利用CHIP-Seq的方法鑒定到了20283個(gè)發(fā)生苯甲?；揎椀奈稽c(diǎn)，其中超過半（57.33%）的苯甲?；揎棸l(fā)生在基因的啟動(dòng)子中（圖6 左上）。類似于賴氨酸的乙?；郊柞；揎椵^少發(fā)生在TSS區(qū)域，而較多地發(fā)生在TSS的上下游（圖6 上中），預(yù)示著苯甲?；谵D(zhuǎn)錄調(diào)控中扮演的重要作用，而作者對(duì)CHIP-Seq數(shù)據(jù)與基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析支持了這一猜想（圖6 右上）。

圖6. 苯甲?；诨蚪M的分布特點(diǎn)及驗(yàn)證

后續(xù)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，苯甲酰化修飾相對(duì)于乙?；揎?，主要調(diào)節(jié)甘油磷脂的代謝，卵巢甾類的合成，水解磷脂酶D的信號(hào)通路，血清素突觸以及胰島素的分泌過程。而RT-qPCR也驗(yàn)證了這些結(jié)論（圖6 下）。

總結(jié)

作為賴氨酸上的新型酰化修飾，苯甲酰化修飾顯得與眾不同，它是已知的發(fā)生在賴氨酸上的唯一含有苯環(huán)的修飾，其修飾基團(tuán)較大（是乙?；?倍）且有較強(qiáng)的疏水性（是乙?；?倍）。

組蛋白通過乙?；{(diào)節(jié)與DNA的相互作用進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)水平，而擁有更加顯著結(jié)構(gòu)影響力的苯甲?；揎椏梢灶A(yù)見對(duì)基因的調(diào)控作用會(huì)更加明顯，作者猜測有蛋白質(zhì)能夠特異性識(shí)別苯甲?；揎棽⒂绊懟虻谋磉_(dá)及染色質(zhì)的構(gòu)型。

此外，苯甲?；揎椏赡軓V泛分布在蛋白質(zhì)組中，在非組蛋白的功能調(diào)控中也發(fā)揮著潛在的重要作用。作為食品添加劑和藥品的苯甲酸鈉，會(huì)在攝入后引起轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該研究為苯甲酸鈉的毒性功能提出了分子機(jī)制探究上的線索。

發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，作為一線科研工作者的我們應(yīng)該怎么趕上這班車？景杰生物作為世界上唯一一家擁有泛苯甲?；揎椏贵w并可開展苯甲酰修飾組學(xué)的公司，可以助力大家進(jìn)行以下方向的研究：

1. 鑒定苯甲酰連接酶和苯甲?；?/p>

2. 利用泛苯甲酰修飾抗體，結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)，研究苯甲酰修飾組學(xué)

3. 研究非組蛋白苯甲酰修飾的功能

4. 研究組蛋白苯甲酰修飾的位點(diǎn)特異性功能

5. 研究苯甲酰修飾的組織及位點(diǎn)特異性

6. 研究苯甲酸鈉及其類似衍生物對(duì)苯甲酰修飾水平的影響，以及產(chǎn)生的后果

7. 從苯甲?；揎椀慕嵌妊芯磕c道微生物與宿主的相互作用

參考文獻(xiàn)

He Huang, et al., 2018, Lysine benzoylation is a histone mark regulated by SIRT2, Nature Communication.