首先獲得待分析的表達數(shù)據(jù)，以芯片數(shù)據(jù)GSE44988為例（https://www.ncbi.nlm./geo/query/acc.cgi?acc=gse44988），在GEO中獲得GSE44988的表達數(shù)據(jù)矩陣（Series Matrix File，如圖1所示）；在其中獲得mRNA的表達數(shù)據(jù)矩陣（GSE44988-GPL7202 seriesmatrix.txt.gz，圖2所示）

GSE44988-GPL16759 seriesmatrix.txt.gz為mRNA的表達數(shù)據(jù)，該芯片為Agilent-014868Whole Mouse Genome Microarray 4x44K G4122F（GPL7202）。GSE44988的mRNA數(shù)據(jù)包括DisColoEpithelium_AOM、DisColoEpithelium_AOMDSS、DisColoEpithelium_DSS和DisColoEpithelium_Control構(gòu)成的4個樣本的3次重復(fù)，共12列數(shù)據(jù)。

2.安裝siggenes包

siggenes基于R語言編寫的軟件包，安裝方法：在R環(huán)境中的安裝方法如下，輸入命令：

## try http:// if https:// URLs are not supported

source('https:///biocLite.R')

biocLite('siggenes')

即可安裝R包siggnes；

browseVignettes('siggenes')

可在R環(huán)境中查看當(dāng)前安裝的siggenes包的版本以及說明名文檔。

然后利用library(siggenes)來載入安裝好的siggenes。

3.導(dǎo)入表達矩陣

這需要預(yù)先做好表達譜矩陣的標準化等過程，獲得一個數(shù)據(jù)矩陣，

read.table('data_matrix.txt',sep='\t',header=TRUE,quote='\'')->data

導(dǎo)入R中的數(shù)據(jù)共有12個樣本（GSM1092784…GSM1093795），以其中6個樣本為例，3個DisColoEpithelium_AOM和3個DisColoEpithelium_Control的樣本，分析AOM與Control組的差異表達基因：

as.character(data$probe)->data$probe

data[,c(1,2:4,11:13)]->data0

獲得數(shù)據(jù)矩陣data0，包含ID號（第1列）、AOM組的表達數(shù)據(jù)（第2-4列，case組）和Control組的表達數(shù)據(jù)第（11-13列，control組）。

4.差異表達分析

rep(c(1,0),c(3,3))->row0

row0是對樣本的分組，case組用1表示，control組用0表示。

利用sam計算獲得的p value和fold change，可繪制火山圖（圖3），展示上調(diào)表達的基因（p value < 0.05，fold change >= 2，綠色點表示），下調(diào)表達的基因（p value < 0.05，fold change <= 0.5，紅色點表示）。

使用FDR假陽性率來篩選顯著差異表達基因更為精確，可設(shè)定FDR值，利用findDelta函數(shù)獲得相應(yīng)的belta值：

findDelta(fdr=0.05,sam.out)

結(jié)果會給出兩組delta值，我們選選擇FDR首先小于0.05的delta值，即，delta=3.880302，此時可獲得2466個差異表達基因。

也可查看delta值區(qū)間內(nèi)取值以及對應(yīng)的FDR和獲得差異表達基因個數(shù)的值：

print(sam.out,seq(3,4,0.1))

當(dāng)設(shè)定FDR=0.05時，delta=3.880302，輸出該閾值下的差異表達基因：

sam2excel(sam.out,delta=3.880302,file='outfile.csv')  

4. 可視化SAM結(jié)果

繪制Delta值與FDR和顯著差異基因的個數(shù)之間的曲線（圖4）：

plot(sam.out)

左邊的圖為選擇Δ參數(shù)時對應(yīng)的fdr的曲線，右邊的圖為選擇Δ參數(shù)時對應(yīng)的差異表達基因數(shù)目曲線。

plot(sam.out,dalta=3.880302)

展示當(dāng)FDR=0.05時，參數(shù)delta為3.880302，此時的差異表達基因的結(jié)果，,綠色的點代表差異表達基因（圖5）。

對于轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)的差異表達分析，可先將RNA-seq數(shù)據(jù)進行表達水平的定量，例如，StringTie、Cufflinks，利用計算好表達水平的RNA-seq數(shù)據(jù)矩陣進行差異基因的識別；另外，Ballgown和Cufflinks也可進行差異表達的識別。DESeq（DESeq2）和EdgeR是專門針對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的差異表達基因識別的R包，但二者都是基于非負整數(shù)read count值矩陣的輸入，htseq –count可對比對結(jié)果SAM格式的文件（SAM formattedaligrment_files ）進行read的計數(shù)，featureCounts也可進行RNA-Seq數(shù)據(jù)的read計數(shù)，輸入文件支持SAM和BAM，自動識別輸入文件格式；另外，coverageBED和summarizeOverlaps等也可進行read的計數(shù)。