一般認為人體內(nèi)存在兩種脂肪，一種是白色脂肪組織（WAT），主要作用是將體內(nèi)多余能量以脂肪的形式儲存起來，廣泛分布于皮下組織和內(nèi)臟周圍；另一種是棕色脂肪組織（BAT），細胞內(nèi)線粒體數(shù)量多，主要負責燃燒脂肪用以產(chǎn)熱，當人體受到寒冷等刺激時，棕色脂肪細胞增加機體能量消耗，促進產(chǎn)熱以維持體溫。

可惜的是如此美好的事物在成人組織中只占一點點。但是，近年來又發(fā)現(xiàn)了第三種脂肪組織：米色脂肪組織，它是第二類產(chǎn)熱脂肪組織。

白色脂肪通過寒冷或運動刺激可以被誘導出現(xiàn)棕色脂肪特性，行使類棕色脂肪功能，出現(xiàn)米色脂肪細胞，這一過程被稱為褐變。所以促進白色脂肪褐變是目前一個很具有吸引力的治療肥胖的新靶點。

下面這篇文章主要是研究褐變過程中l(wèi)ncRNA發(fā)揮作用的分子機制。

發(fā)表雜志：Plos Biology

影響因子：9.797（2017）

肥胖癥在發(fā)達國家和發(fā)展中國家已經(jīng)達到了流行病的比例，提高BAT活性和促進WAT褐變是治療肥胖癥和相關代謝紊亂極具吸引力的方法。 研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）參與脂肪細胞的多個生物學過程中，但對于lncRNAs在脂肪能量代謝中的作用的研究仍處于初級階段。

該研究通過分析WAT褐變、BAT活化和BAT失活過程中的mRNA和lncRNA的表達譜，進行mRNA和lncRNA相關性分析，構(gòu)建框架來研究lncRNAs在能量平衡和脂肪動力學中的功能。

1.  寒冷暴露（4℃，7天）、beta-腎上腺素激動劑（CL316243,1mg/kg, 7天）、游泳運動誘導WAT褐變后，進行轉(zhuǎn)錄組測序。

2.  寒冷暴露（4℃，6 h， BAT活化）、和熱中性失活（30℃，7天，白化），進行轉(zhuǎn)錄組測序。

3.  WAT和BAT細胞敲降lncBATE10后進行RNA-seq，檢測下游調(diào)控基因。

利用三種廣泛采用的方法誘導WAT褐變，包括長期的寒冷暴露（4℃，7天），beta-腎上腺素激動劑（CL316243, 1mg/kg, 7天）、游泳運動（圖1 A）。3種條件下動物的食物攝取量均增加，寒冷和運動條件下動物的體重顯著降低。附睪WAT（eWAT）質(zhì)量在3種條件下均顯著降低，而腹股溝WAT（iWAT）只在寒冷和運動條件下降低。

BAT質(zhì)量在游泳訓練后質(zhì)量增加了約30%，而CL316243和寒冷刺激則沒有引起顯著變化。H&E染色結(jié)果顯示，在3種條件下脂肪細胞大小均顯著減少，冷處理的細胞表型和BAT最為相似，表明這對褐變的刺激比其他兩個要更強烈。

mRNA層級聚類分析結(jié)果表明，每種條件下的樣品緊密聚集，而基于lncRNA表達的聚類結(jié)果完全反映了對mRNAs的觀察模式（圖1 B）。

因此，基于lncRNA的表達譜似乎是更強大的脂肪狀態(tài)的分子標記，可以用來表征脂肪組織對不同環(huán)境刺激的反應。

圖1 WAT褐變相關的轉(zhuǎn)錄組變化

在寒冷、CL316243和運動處理下，673個上調(diào)、826個下調(diào)的mRNAs（圖1 D,F），iWAT三種條件中有301個共同上調(diào)、49個共同下調(diào)的基因，Ucp1、Elvol3、 Cidea、以及和線粒體相關的基因如所預期的也位于其中。

針對29個小鼠不同組織，通過查詢基因本體生物學過程（GOBPs）以及高度特異性的BAT和WAT表達基因集進行基因集富集分析（GSEA），上調(diào)的信號通路包括BAT特異性基因集、細胞呼吸和氧化能量衍生，表明類BAT表型的獲得；下調(diào)的信號通路包括WAT特異性信基因集和一些免疫-功能相關的生物學過程，暗示褐變過程中WAT特征的喪失以及免疫細胞的重塑。

相應地lncRNA的分析結(jié)果顯示，三種條件下有49個lncRNAs上調(diào)、98個lncRNAs下調(diào)，其中17個共同上調(diào)、42個共同下調(diào)（圖1 E,G）。由于大多數(shù)的lncRNAs缺少功能注釋，因此推測lncRNA的可能調(diào)控功能是基于29個小鼠器官和細胞類型上的組織特異表達譜。上調(diào)和下調(diào)的mRNAs以及l(fā)ncRNAs分別與BAT-enriched基因集、免疫細胞相關基因集顯示最強的重疊（圖1 H,I），這表明受調(diào)控的lncRNAs也可以在BAT相關的生理過程和免疫細胞重塑中起作用。

通過公開的ChIP-seq數(shù)據(jù)獲得在BAT和WAT中PparY和Prdm16的富集區(qū)域圖譜，檢測各種褐變條件下mRNAs和lncRNAs啟動子區(qū)域過氧化物酶體增殖物激活受體（PparY）和PR結(jié)構(gòu)域蛋白16（Prdm16）的富集。

在每種褐變條件下，對于mRNAs和lncRNAs，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點與上調(diào)基因啟動子高度顯著重疊，尤其是寒冷處理條件下顯示出最強的重疊（圖 1J），暗示PparY和Prdm16可能在mRNAs和lncRNAs表達過程中起著調(diào)節(jié)作用。例如lncBATE10在褐變后基因表達出現(xiàn)劇烈變化（圖 1K），并且發(fā)現(xiàn)其啟動子和gene body區(qū)域包含多個PparY和Prdm16結(jié)合位點。

接下來檢測BAT活化（寒冷暴露6h）和熱中性失活（30℃，7天，簡稱白化）過程中差異轉(zhuǎn)錄本變化（圖 2A）?；罨陂g682個mRNAs上調(diào)、白化期間232個mRNAs下調(diào)，其中143個基因重疊；相反地，活化期間500個mRNAs下調(diào)、白化期間239個mRNAs上調(diào)。其中58個基因重疊（圖2 B,C）。

因此，受兩種刺激調(diào)節(jié)的基因呈現(xiàn)相反的調(diào)控方向。GSEA富集分析結(jié)果顯示BAT活化過程中WAT特異性基因集表達的增加以及BAT特異性基因集表達的缺失。轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，如RNA過程和翻譯，在BAT活化過程中被強烈誘導，而在BAT失活過程中被抑制，表明這種調(diào)控可能是BAT功能調(diào)控網(wǎng)絡管理的一個組成部分。

圖2 褐變與白化過程中的基因與網(wǎng)絡表達

基于5種不同條件（3種褐變條件、以及BAT活化和BAT失活條件）下的轉(zhuǎn)錄組變化表征，研究者試圖確定多種條件下顯著受調(diào)節(jié)的基因，尤其是在褐變和BAT活化中上調(diào)并在BAT白化中下調(diào)的基因。

在5種條件下至少4個被誘導進行篩選，發(fā)現(xiàn)60個mRNAs出現(xiàn)顯著變化，包括Ucp1, Dio2, Fabp3等脂肪酸代謝過程中的關鍵基因。在相同的條件下篩選確定了6個lncRNAs，包括lncBATE10（圖2 D,E）。

lncRNA PCA分析結(jié)果與mRNA PCA分析結(jié)果一致（圖 2 G），樣品根據(jù)不同的處理條件分離成不同的簇，mRNAs和lncRNAs轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)變化似乎在這些生理過程中緊密配合，表明mRNAs和lncRNAs之間存在內(nèi)在功能連接。

為了系統(tǒng)地預測lncRNA功能，選擇在5種檢測條件下至少在3種中受調(diào)節(jié)的mRNAs和lncRNAs，共得到了819個mRNAs和79個lncRNAs。然后對18個樣品計算每對mRNA和lncRNA的偏相關性，并利用GeneNet對偏相關矩陣構(gòu)建mRNA-lncRNA網(wǎng)絡。

通過檢測與lncRNA顯著共表達并相關的mRNAs生物學過程，來初步確定每個lncRNA的生物學功能。基因共表達網(wǎng)絡聚類進一步揭示了主要的3個簇（圖 2H），對于每一個簇，將基因分組成四個功能大類，包括代謝過程、免疫過程、細胞過程等。其中，氧化磷酸化和呼吸電子傳遞在簇1和2中顯著富集，免疫功能相關的過程在簇3中顯著富集。

之前的研究證明，在棕色脂肪細胞和白色脂肪細胞中，lncBATE1對于完整的BAT程序表達是必需的。在構(gòu)建的mRNA-lncRNA網(wǎng)絡中，lncBATE1與Cebpβ、Dio2、Ucp1、Fabp3、Elvol3和其他脂質(zhì)代謝基因相關聯(lián)，證明了構(gòu)建方法的有效性。

值得注意的是，lncBATE1還與另一個lncRNA-lncBATE10存在關聯(lián)，兩者都與Ucp1、Dio2、Dgat1等其他脂質(zhì)分解代謝相關基因共表達，暗示lncBATE10在BAT相關過程中的功能調(diào)控作用。

與eWAT、iWAT和其他大部分組織相比，lncBATE10在BAT中高度富集（圖3 A,B），并且表達量在lncRNA轉(zhuǎn)錄本中位于第三。

通過體外分離原代棕色和白色前脂肪細胞，檢測lncBATE10在體內(nèi)分化過程中的時間表達情況。結(jié)果顯示，lncBATE10在棕色脂肪細胞分化過程中上調(diào)倍數(shù)大于100倍，并且在培養(yǎng)的第4天和第6天，在棕色脂肪細胞中的表達比白色脂肪細胞中高10倍以上（圖3 C）。

為了確定lncBATE10表達是否與BAT活性相關，通過寒冷刺激（4℃，6h）小鼠激活BAT，熱中性（30h，7天）使BAT失活。結(jié)果顯示，相較于對照，lncBATE10在BAT活化中表達量上調(diào)約7倍，在BAT失活中表達量被抑制約60%。并且在寒冷、運動和CL316243處理引起的iWAT褐變中，lncBATE10被誘導表達（圖3 D,E,F）。這些結(jié)果強烈顯示lncBATE10可能在BAT和iWAT褐變中起調(diào)控作用

圖3 BAT中高度富集的lncBATE10對BAT特異性基因表達必不可少

為了確定lncBATE10的生物學功能，在原代棕色前脂肪細胞中敲降lncBATE10的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncBATE10敲低后沒有觀察到細胞形態(tài)學的差異變化和脂質(zhì)積累。

qPCR分析顯示泛生脂標記物，Cebpa, PparU和Fabp4，出現(xiàn)輕微下調(diào)。lncBATE10的下調(diào)顯著降低BAT特異性基因mRNA和蛋白的表達水平，如Ucp1和Pgc1α。

利用lncBATE10敲降和對照細胞的RNA-seq，在全基因組水平確定lncBATE10缺失造成的影響。GSEA分析結(jié)果顯示，下調(diào)最顯著的信號通路與呼吸電子傳遞相關，這是BAT功能的標志之一。

BAT和骨骼肌有著相同的起源，并在某些條件下可以轉(zhuǎn)換成WAT表型，檢測WAT和肌細胞分子標記物的基因表達發(fā)現(xiàn)，lncBATE10敲低沒有引起明顯的變化。利用1uM 去甲腎上腺素(NE)處理分化的棕色脂肪細胞，進一步檢測lncBATE10對棕色脂肪細胞活化的影響。結(jié)果顯示，NE處理顯著刺激產(chǎn)熱基因Ucp1和Pgc1α的表達，但敲低lncBATE10后誘導效應被減弱。因此，lncBATE10對于BAT特異性基因的完全誘導是必不可少的。

在原代棕色前脂肪細胞中過表達lncBATE10，并誘導其分化，發(fā)現(xiàn)沒有引起脂質(zhì)積累和細胞形態(tài)學以及BAT分子標記表達的顯著變化，表明lncBATE10豐度能夠滿足正常的分化，或者說lncBATE10需要輔助因子才能行使功能。

過表達lncBATE10進行RNA-seq分析，GSEA分析結(jié)果顯示，多數(shù)的上調(diào)信號通路與營養(yǎng)代謝有關，包括氨基酸降解、脂肪酸降解、TCA循環(huán)等，表明lncBATE10在調(diào)控代謝途徑起著重要作用。

進一步檢測lncBATE10是否在棕色脂肪形成晚期起作用，在永生化棕色前脂肪細胞系中過表達lncBATE10，但沒有觀察到BAT特異性分子標記的表達。

在原代白色脂肪細胞中敲降lncBATE10的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncBATE10敲低后沒有觀察到細胞形態(tài)學、脂質(zhì)積累或泛生脂肪標記的差異變化。但是BAT特異性基因表達出現(xiàn)顯著下調(diào)。通過RNA-seq和GSEA分析，進一步檢測敲降lncBATE10后引起的全基因組效應，結(jié)果顯示，與呼吸電子傳遞相關的信號通路顯著下調(diào)。

有趣的是，白色脂肪和棕色脂肪中大部分信號通路是相同的，表明lncBATE10在兩種細胞類型中具有相似的作用。為了確定lncBATE10在WAT褐變中的功能，在WAT細胞敲低lncBATE10，并用NE或NE聯(lián)合羅格列酮（rosiglitazone）來處理細胞。

結(jié)果顯示，藥物治療可顯著誘導BAT分子標記的表達，如Cidea和Ucp1，但敲低lncBATE10會使這些基因表達減弱。為了檢測lncBATE10是否足以促進WAT褐變，在iWAT脂肪細胞和3T3-L1細胞中過表達lncBATE10，并沒有觀察到標記表達的差異變化，表明lncBATE10是BAT選擇性表達程序所必需的，但并不充分。

為了檢測lncBATE10在體內(nèi)WAT褐變中的功能，在小鼠iWAT每側(cè)注射lncBATE10干涉腺病毒，48后將小鼠進行寒冷處理誘導褐變，檢測組織中BAT特異性標記。結(jié)果顯示，約80%的lncBATE10被敲除，并伴隨著BAT特異性標記的顯著下調(diào)，包括Ucp1、Dio2和 Pgc1α，但不包括泛生脂肪標記物PparY。Western blot進一步驗證了Ucp1和 Pgc1α蛋白水平的下調(diào)。因此，lncBATE10誘導對于體內(nèi)WAT褐變是必需的。

如 圖3 D 所示，通過寒冷處理，lncBATE10與beta-腎上腺素能使受體-cAMP信號通路出現(xiàn)顯著變化。利用NE和cAMP分別處理棕色脂肪細胞，在兩種條件下均檢測到lncBATE10的快速誘導（圖4A），證明了cAMP通路在lncBATE10表達中的調(diào)控作用。

cAMP是可以通過磷酸化調(diào)控下游基因，如Ucp1和Pgc1α，并激活轉(zhuǎn)錄因子Creb（cAMP應答元件結(jié)合蛋白）的表達，推測Creb可以調(diào)控lncBATE10的轉(zhuǎn)錄。

MatInspector序列分析發(fā)現(xiàn)了lncBATE10啟動子區(qū)域存在一些Creb結(jié)合位點，熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，啟動子2.6kb區(qū)域存在響應cAMP信號的調(diào)控元件。

棕色脂肪細胞ChIP-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)orskolin（激活cAMP表達）處理后，Creb與鑒定的結(jié)合位點之間的結(jié)合顯著上調(diào)（圖4）?？傊?，這些結(jié)果表明lncBATE10受到cAMP-Creb信號通路的調(diào)控。

圖4 lncBATE10受到cAMP-Creb信號通路的調(diào)控

為了理解lncBATE10行使功能的具體機制，研究者在體外轉(zhuǎn)錄加生物素標記的lncBATE10，并對lncBATE10相互作用的蛋白質(zhì)pull down后進行質(zhì)譜分析。結(jié)果顯示，RNA結(jié)合蛋白（RBPs）高度富集，并與RNA過程密切相關。其中，鑒定了34個含有多于10個特異肽段的蛋白質(zhì)，以及相較于對照高度富集的3個RBPs，HuR、Celf1和Celf2。

針對HuR、Celf1和Celf2進行RIP-PCR，檢測lncBATE10的表達水平，結(jié)果顯示，Celf2的IP表現(xiàn)出非常強的富集信號（圖5A），因此選擇Celf2進行進一步的研究。

圖5 lncBATE10與Pgc1α mRNA競爭性結(jié)合Celf1

 Celf1已知的一個功能是結(jié)合其靶基因mRNA的3’UTR，促進RNA降解和抑制翻譯。猜測lncBATE10作為海綿捕獲Celf1，否則Celf1可能抑制BAT分化和激活重要因子的表達。

Celf1 RIP實驗結(jié)果顯示，敲降lncBATE10后Pgc1α mRNA被顯著富集（圖5 B,C），表明lncBATE10通過靶定Celf1保護Pgc1αmRNA。但是敲降lncBATE10的細胞中沒有檢測到Celf1蛋白的顯著變化。

檢測lncBATE10和Pgc1α mRNA的序列，來尋找Celf1蛋白結(jié)合位點（CBS），以前的研究表明可能富含UCU區(qū)域。在本研究有兩個類似的片段被鑒定出來（約60nt）（圖5 D），為了檢測這些區(qū)域是否可以結(jié)合Celf1，作者擴增并在體外轉(zhuǎn)錄這兩個片段，進行RNA-pull down分析，結(jié)果顯示，這兩個片段可以充分拉下Celf1，表明擁有Celf1結(jié)合位點（圖5 E）。

上述結(jié)果表明lncBATE10和Pgc1α競爭性結(jié)合Celf1，但是Celf1是否能抑制Pgc1αmRNA的表達還不確定。在原代棕色前脂肪細胞中過表達Celf1，分化后，發(fā)現(xiàn)Pgc1α mRNA和蛋白水平都被顯著抑制。并且在Celf1過表達時脂肪生成被中度抑制，暗示降低的Pgc1α水平可能受到脂肪形成的間接影響。

為了排除脂肪形成過程中的間接影響，在分化5天的原代棕色前脂肪細胞中干涉Celf1的表達，Pgc1α和lncBATE10表達均增加。

為了檢測Celf1是否通過識別的結(jié)合位點抑制Pgc1α mRNA的表達，將Pgc1α mRNA和lncBATE10的Celf1結(jié)合位點片段克隆到熒光素酶報告載體中，如預期那樣，含有Celf1結(jié)合位點會導致熒光素酶活性顯著降低，其可以通過敲低內(nèi)源性Celf1顯著被抑制（圖5 K,M,N）。

進一步構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染到原代棕色前脂肪細胞中也觀察到類似的結(jié)果。因此，確定了Celf1通過作用于結(jié)合位點抑制Pgc1αmRNA的活性。

1．本文研究思路是lncRNA功能研究的一般思路，首先尋找不同條件下的差異變化lncRNA，并將lncRNA與mRNA進行關聯(lián)分析，尋找有功能的候選lncRNA進行后續(xù)分析，最終選擇lncBATE10作為目標分子。

2．通過敲降目標分子lncBATE10，尋找下游調(diào)控分子，最終發(fā)現(xiàn)lncBATE10與Pgc1αmRNA競爭性結(jié)合Celf1這一調(diào)控機制。

3．本文分子機制研究思路嚴謹，論證詳細，值得借鑒。

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