題記

一般來說，做通路機(jī)制問題屬于性價比不太高的研究，但是為了更好地說明問題、證明觀點，往往需要一些分子機(jī)制研究，因此，十分必要了解一些經(jīng)典的通路研究方法。

這次分享的就是一篇非常全面地腫瘤糖代謝研究，發(fā)表在Cancer Cell (IF=27)，MUC1 and HIF-1alpha Signaling Crosstalk Induces Anabolic Glucose Metabolism to Impart Gemcitabine Resistance to Pancreatic Cancer。（回復(fù)170901可下載，一周有效）

以往研究表明：

1）癌癥組織內(nèi)會發(fā)生明顯的代謝改變，低氧會導(dǎo)致HIF-1α水平升高，進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)胞對糖的攝取。

2）而腫瘤細(xì)胞內(nèi)糖的增加不僅會導(dǎo)致糖酵解途徑增強(qiáng)，同時增加生物合成。

3）低氧也是許多腫瘤，包括胰腺癌，對治療產(chǎn)生耐受的重要原因。

4）而大部分腫瘤耐藥研究認(rèn)為耐藥性的產(chǎn)生是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物內(nèi)流與外排比例降低導(dǎo)致的。

但是，這篇文章則證明了HIF-1α引起糖酵解途徑增加和嘧啶合成增加，是胰腺癌對吉西他濱產(chǎn)生耐藥的機(jī)制，靶向作用于HIF-1α能夠增加吉西他濱的有效性。文章提出了新的腫瘤耐藥機(jī)制。

文章研究的思路主要是，通過體外細(xì)胞實驗→動物體內(nèi)實驗→人體標(biāo)本/臨床隨訪，尋找腫瘤耐藥機(jī)制糖代謝變化的情況、原因（上游）、后果（下游），并證明對上游的阻斷可以改善腫瘤耐藥。

胰腺癌細(xì)胞吉西他濱耐藥是由于糖代謝增加導(dǎo)致

吉西他濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞（以下稱為Gem-R細(xì)胞，由胰腺癌細(xì)胞系Capan-1, T3M4, MIA PaCa-2分別經(jīng)吉西他濱處理獲得），Gem-R細(xì)胞在正常氧濃度和低氧濃度下，都表現(xiàn)出糖攝取增加（[3H]-2-deoxyglucose）、乳酸釋放增加，且糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平（mRNA）都增加。通過LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)Gem-R細(xì)胞內(nèi)糖酵解中間代謝產(chǎn)物增加。（圖F和G）

進(jìn)一步證明胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生吉西他濱耐藥是由于上述觀察到的Gem-R細(xì)胞內(nèi)糖代謝的變化導(dǎo)致的？細(xì)胞外低糖環(huán)境下，Gem-R細(xì)胞存活減少（圖H）；Gem-R細(xì)胞外酸化率（ECAR）增加和氧消耗率（OCR）減少（圖I和J）。

使用流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）表達(dá)高低將Gem-R細(xì)胞分為兩組，發(fā)現(xiàn)GLUT1表達(dá)低的Gem-R細(xì)胞對吉西他濱敏感性強(qiáng)于GLUT1表達(dá)高的Gem-R細(xì)胞。

體內(nèi)實驗，裸鼠原位抑制Gem-R細(xì)胞，18F-FDG PET/CT發(fā)現(xiàn)Gem-R細(xì)胞糖攝取明顯高于野生型（圖L）；對接受氟尿嘧啶類似物（吉西他濱或者5-FU）治療的胰腺癌患者進(jìn)行18F-FDG PET/CT，發(fā)現(xiàn)18F-FDG攝取較高的患者，其用藥情況下無進(jìn)展存活期較差（圖M）。

綜上，研究者證明了吉西他濱耐藥細(xì)胞依賴于糖代謝改變。默默覺得只有這些實驗也能發(fā)表一篇相當(dāng)好的文章了。研究者接下來對糖代謝改變進(jìn)行了上下游的研究。

Gem-R細(xì)胞內(nèi)葡萄糖增加通過非氧化磷酸戊糖途徑

通過LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)糖代謝增加主要通過非氧化的磷酸戊糖途徑（PPP，圖A和B）；與非氧化PPP相關(guān)的基因表達(dá)水平增加（圖C）。

為了進(jìn)一步確定非氧化PPP對糖代謝增加的作用，通過1-14C-葡萄糖（氧化PPP和三羧酸循環(huán)釋放）和6-14C-葡萄糖（只通過三羧酸循環(huán)釋放）的攝取比例檢測，發(fā)現(xiàn)Gem-R細(xì)胞內(nèi)二者比例降低，提示非氧化PPP途徑增加（圖D）。

進(jìn)一步通過U-13C-葡萄糖標(biāo)記PPP代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Gem-R細(xì)胞內(nèi)葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑更快（G6P/F6P/FBP），而進(jìn)入氧化PPP途徑變慢（6PGL）。

至此完成了Gem-R細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝途徑改變下游比較完整的研究。

Gem-R細(xì)胞內(nèi)嘧啶合成增加也與吉西他濱耐藥有關(guān)

LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析以及后續(xù)的代謝通路和功能富集分析發(fā)現(xiàn)嘧啶合成通路是Gem-R細(xì)胞內(nèi)最顯著變化的通路之一（圖A），嘧啶合成中間代謝產(chǎn)物增加（圖B），嘧啶合成相關(guān)基因表達(dá)水平增加（圖C），說明在Gem-R細(xì)胞內(nèi)嘧啶合成增加。

來氟米特（乳清酸脫氫酶抑制劑，抑制嘧啶合成）和吉西他濱，能夠明顯減少Gem-R細(xì)胞存活，減少裸鼠腫瘤體積，降低細(xì)胞增殖情況（圖E-G）。說明嘧啶合成增加也參與了吉西他濱耐藥過程。

Gem-R細(xì)胞內(nèi)脫氧胞嘧啶增加降低了吉西他濱治療有效性

Gem-R細(xì)胞內(nèi)所有核苷酸水平均升高（A），培養(yǎng)基中加入脫氧胞嘧啶能夠明顯增加Gem-R細(xì)胞存活，而增加其他種類脫氧核苷酸沒有明顯的增加細(xì)胞存活的作用（B和C）。而且，對胰腺癌病人快速冰凍組織檢測發(fā)現(xiàn)，高濃度脫氧胞嘧啶的患者存活時間短于低濃度脫氧胞嘧啶患者（F）。

HIF-1α是調(diào)節(jié)Gem-R細(xì)胞糖代謝增強(qiáng)和嘧啶合成增加的主要分子

Gem-R細(xì)胞在正常氧濃度和低氧情況下，HIF-1α和其調(diào)控的蛋白表達(dá)水平均增加（A）；敲除HIF-1α和HIF-2α之后，WT和Gem-R細(xì)胞內(nèi)糖攝取和細(xì)胞存活均下降（B-D），HIF-1α敲除后更明顯。

同樣可見于其他非吉西他濱耐藥的胰腺癌細(xì)胞系（PANC-1，MIA PaCa-2，圖E-G）；Gem-R細(xì)胞內(nèi)敲除HIF-1α后，細(xì)胞對吉西他濱敏感性增加（H）。低氧誘導(dǎo)Gem-R細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加，或者加入地高辛抑制HIF-1α翻譯，發(fā)現(xiàn)HIF-1α能夠增加CTPS1和TKT的表達(dá)（圖I）。

裸鼠種植瘤組織內(nèi)觀察到CTPS和TKT與EF5（低氧標(biāo)志物）共定位，與CA IX（HIF-1α活性標(biāo)志物）共定位，患者胰腺癌組織中也觀察到CTPS和TKT與CA IX共定位。

這些結(jié)果都說明了HIF-1α通過調(diào)節(jié)CTPS1和TKT表達(dá)介導(dǎo)了胰腺癌細(xì)胞的吉西他濱耐藥性。

靶向作用于HIF-1α能夠增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性

使用地高辛（HIF-1α抑制劑）或者敲除Gem-R細(xì)胞內(nèi)HIF-1α后，把上面的實驗全部重復(fù)一遍，包括細(xì)胞內(nèi)脫氧胞嘧啶水平、細(xì)胞存活、裸鼠原位種植瘤的體積、種植瘤內(nèi)細(xì)胞增殖情況（Ki-67染色陽性）。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制HIF-1α或者敲除HIF-1α之后，能夠增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱的敏感性。

其實研究者還進(jìn)行了MUC1的研究，CTPS和TKT水平下降對吉西他濱敏感性的影響，在此不多做介紹。看起來非常復(fù)雜的通路研究，其實內(nèi)在的邏輯很簡單。