|
A、臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定：壞死細(xì)胞胞膜破裂，染料能進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞染成藍(lán)色；正常細(xì)胞或者凋亡細(xì)胞胞膜完整，對(duì)臺(tái)盼藍(lán)拒染。這一方法結(jié)合電鏡觀察更加準(zhǔn)確，電鏡下可見凋亡細(xì)胞表面纖毛喪失，細(xì)胞核沿核膜內(nèi)側(cè)邊緣開始固縮，電子密度升高等。 B、Hoechst33342、PI染色，熒光顯微鏡觀察：兩者均為僅與細(xì)胞核DNA結(jié)合的染料，熒光鏡下可鑒別凋亡與死亡細(xì)胞的核變化。利用Hoechst33342-PI染色法，正常細(xì)胞對(duì)染料有抗拒性，熒光染色很淺；凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光；而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強(qiáng)的紅色熒光。 C、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。壞死細(xì)胞不出現(xiàn)凋亡小體。 D、DNA凝膠電泳檢測(cè)其片段化：凋亡細(xì)胞染色體在核酸內(nèi)切酶的作用下出現(xiàn)核小體間有規(guī)律斷裂，斷裂的DNA片段約為180bp或其整數(shù)倍，這是凋亡細(xì)胞最重要的生化特征。凋亡細(xì)胞DNA凝膠電泳能觀察到DNA片段組成的梯形條帶，而壞死細(xì)胞DNA由于被溶酶體中DNA酶切割成連續(xù)大小的片段，在DNA凝膠上呈現(xiàn)為彌散模糊的條帶。 E、流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：凋亡細(xì)胞通過DNA熒光染色，有如下流式細(xì)胞學(xué)特征：DNA特異性熒光減少，細(xì)胞漿膜完整，線粒體仍有跨膜電位，蛋白含量明顯減少等。根據(jù)以上特征，Huschtscha等用碘化丙啶染色及細(xì)胞光散射的特點(diǎn)提出了檢測(cè)凋亡細(xì)胞并與壞死細(xì)胞相區(qū)別的方法。在DNA直方圖上，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)二倍體峰的減少，二倍體峰左側(cè)出現(xiàn)亞二倍體細(xì)胞群的峰型。而壞死時(shí)，細(xì)胞周期中的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的減少，亞二倍體細(xì)胞量多少不等。在光散射圖上，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)低于正常的前向散射和較高的側(cè)散射，壞死時(shí)則呈現(xiàn)單一的前、側(cè)高散射。 2、試比較腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體的主要優(yōu)缺點(diǎn)。
3、軟瓊脂集落生成的技術(shù)路線及實(shí)驗(yàn)意義。 一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線： 1瓊脂制備：用雙蒸水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低溶點(diǎn)瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，維持在40℃中勿令凝固。 2制備出2xDMEM（含2x抗生素和20%牛血清），過濾除菌后，保存于37℃?zhèn)溆谩?/span> 3底層瓊脂制備：按1：1混合1.2%的瓊脂糖和2xDMEM后，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中，待冷卻凝固，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。 4單細(xì)胞懸液制備：用細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，計(jì)算細(xì)胞活率并計(jì)數(shù)后備用。 5上層瓊脂制備：按1：1比例將0.7%瓊脂和2xDMEM在無菌試管中混勻,總體積為3ml，再向管中加入約1000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,充分混勻、注入已鋪有底層瓊脂的平皿中，形成雙瓊脂層。 6待上層瓊脂凝固后，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。 7觀察細(xì)胞集落。 8集落計(jì)數(shù)方法： （1） 倒置顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)集落數(shù)。 （2）一般以直徑>60um的細(xì)胞集落為一個(gè)克隆，但根據(jù)細(xì)胞類型不同而略有差異。 （3） 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析組間差異。 二、實(shí)驗(yàn)意義： 軟瓊脂集落生成實(shí)驗(yàn)是目前檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞最為常用的方法，也是與細(xì)胞惡性程度最相符合的方法。是體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?對(duì)是否具有體內(nèi)成瘤性具有重要的提示作用。 4、簡述雜交瘤方法制備單克隆抗體過程中HAT選擇培養(yǎng)的原理。 單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。 細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依據(jù)是細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（“S途徑”），它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩種酶缺一不可。因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個(gè)效應(yīng)B細(xì)胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷，雖“S途徑”正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力，一般10d左右會(huì)死亡。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT）細(xì)胞，因此自身沒有“S途徑”，且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞，既具有效應(yīng)B細(xì)胞的“S途徑”，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。 5、簡述單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理及其應(yīng)用。 一、實(shí)驗(yàn)原理： 將單個(gè)細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解處理后，再在電場(chǎng)中進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色，受損細(xì)胞中形成的DNA片段在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案，而正常的無DNA斷裂的核在泳動(dòng)時(shí)保持圓球形。 有核細(xì)胞的DNA超螺旋結(jié)構(gòu)附著在核基質(zhì)中，用瓊脂糖凝膠將細(xì)胞包埋在載玻片上，在細(xì)胞裂解液的作用下，細(xì)胞膜、核膜及其它生物膜遭到破壞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)及其它成分進(jìn)入凝膠，繼而擴(kuò)散到裂解液中，但核DNA仍保持纏繞的環(huán)區(qū)附著在剩余的核骨架上，并留在原位。如果細(xì)胞未受損傷，電泳時(shí)，核DNA因其分子量大停留在核基質(zhì)中，熒光染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無脫尾現(xiàn)象。若細(xì)胞受損，在堿性電泳液（pH>13）中，先是DNA雙鏈解螺旋且堿變性為單鏈，單鏈斷裂的碎片分子量小可進(jìn)入凝膠中，電泳時(shí)斷鏈或碎片離開核DNA向陽極遷移，形成拖尾。細(xì)胞核DNA 受損傷越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈或堿變性斷片就越多，片段也越小，電泳表現(xiàn)為尾長增加和尾部熒光增強(qiáng)。因此，通過測(cè)定DNA 遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測(cè)定單個(gè)細(xì)胞損傷的程度。彗星試驗(yàn)檢測(cè)單細(xì)胞水平DNA 損傷，無需放射性示蹤，適用于各種有核細(xì)胞，樣品用量少，試驗(yàn)周期短，靈敏、快速、簡便。 二、實(shí)驗(yàn)應(yīng)用： （1）在檢測(cè)誘變劑、射線等對(duì)DNA的損傷、監(jiān)測(cè)環(huán)境污染物對(duì)機(jī)體的遺傳損害、研究毒物致癌機(jī)制等方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。 （2）現(xiàn)被應(yīng)用于遺傳毒理、放射生物學(xué)、生物監(jiān)測(cè)、癌癥化療和細(xì)胞凋亡、衰老等領(lǐng)域，尤其應(yīng)用于新藥開發(fā)、保健品開發(fā)、化妝品開發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)和毒理學(xué)研究等領(lǐng)域。 （3）進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。 6、簡述免疫組化技術(shù)方法的原理及優(yōu)點(diǎn)。 舉例說明在免疫組化實(shí)驗(yàn)中如何設(shè)置對(duì)照系統(tǒng)？ 一、原理：免疫細(xì)胞化學(xué)又稱為免疫組化，是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體（或抗原）的顯色劑 (熒光素、酶、生物素、金屬離子等) 顯色來確定細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)抗原（或抗體）的成分，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。 二、優(yōu)點(diǎn)： 1.高度的特異性?？乖贵w反應(yīng)是特異性最強(qiáng)的反應(yīng)之一，免疫細(xì)胞化學(xué)所用的抗體必須是特異性強(qiáng)的多價(jià)或單價(jià)抗體，具有高度的認(rèn)別能力，在抗原識(shí)別上可達(dá)到單個(gè)氨基酸的水平，這是其它組織化學(xué)方法難以相比的。 2. 敏感性高,現(xiàn)代免疫細(xì)胞化學(xué)采用各種有效方法最大限度保存細(xì)胞和組織內(nèi)待檢物質(zhì)的抗原性；使用高度敏感的和高親和力的抗體，保證可檢出細(xì)胞內(nèi)超微量的抗原分子，用顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果，因此，它是在細(xì)胞、分子水平或基因水平的檢測(cè)技術(shù)。 三、 如何設(shè)置對(duì)照系統(tǒng)： （一）、直接免疫熒光法設(shè)置對(duì)照： 自發(fā)熒光對(duì)照(空白對(duì)照)：加PBS代替一抗。 同型對(duì)照：免疫前血清的抗體 陽性對(duì)照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。 特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn))：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特 異性抗體(可省略)。 已知的細(xì)胞對(duì)照。 （二）、間接免疫熒光法設(shè)置對(duì)照： 空白對(duì)照：用PBS代替一抗 同型對(duì)照 陽性對(duì)照 已知細(xì)胞的對(duì)照 7、簡述DNA損傷與修復(fù)研究方法的原理并舉出2種研究方法。 一、修復(fù)方法及原理 1、光復(fù)活：由光復(fù)活酶催化，直接利用300-600nm波長的光量子能量來完成。其基本過程是：先是每個(gè)光復(fù)活酶分子與一個(gè)嘧啶二聚體相結(jié)合而形成復(fù)合體（這一步不需要光）。復(fù)合體吸收300-600nm的光，是嘧啶二聚體中的兩個(gè)交聯(lián)共價(jià)鍵裂開，復(fù)原為兩個(gè)正常的嘧啶單體，此步反應(yīng)叫單體化作用。接著光復(fù)活酶從DNA上脫離，DNA分子恢復(fù)原樣。光復(fù)活作用不涉及磷酸酯鍵的切開，沒有發(fā)生新的合成，也無其他副產(chǎn)物，屬于無錯(cuò)修復(fù)。 2、堿基切除修復(fù)：在細(xì)菌和真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)多種DNA糖苷酶，它們能識(shí)別和切除某些錯(cuò)誤的或損傷的堿基。絕大多數(shù)DNA糖苷酶，對(duì)其所能識(shí)別的切除的堿基對(duì)象有高度的專一性。切除時(shí)的作用原理，是將堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵水解斷裂，釋放出游離的堿基，從而在DNA鏈上造成一個(gè)無嘌呤或無嘧啶的AP位點(diǎn)，主鏈并不切斷。 二、研究方法： 1、放射自顯影：在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷等放射源,用放射自顯影方法計(jì)數(shù)銀顆粒數(shù)來測(cè)定修復(fù)合成過程中參入到DNA分子中的量。 2、超速離心法：一種應(yīng)用比較廣泛的方法，可應(yīng)用于切除修復(fù)、復(fù)制后修復(fù)及鏈斷裂修復(fù)方式的檢測(cè)。一般是用氚標(biāo)記溴脫氧尿嘧啶核苷等參入到修復(fù)合成的DNA分子中去以改變DNA分子的重量(BrdU的分子量比尿嘧啶核苷大),通過超速離心可以從沉降系數(shù)不同的各組分中收集修復(fù)合成中參入量不同的DNA片斷,然后分別測(cè)定其放射性的強(qiáng)度來判斷修復(fù)合成的多少。 8、如果要用Western blot檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上某種蛋白的磷酸化改變，如何配置緩沖液和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作？敘述關(guān)鍵步驟和配方的基本原理。 檢測(cè)磷酸化時(shí)必須加磷酸酶抑制劑，緩沖液須高鉀/高鎂/高錳，低鈉/低鈣。 實(shí)驗(yàn)過程中必須在同一次Western blot中區(qū)分某蛋白磷酸化與否。 1、選擇可將磷酸化與否分成不同區(qū)帶的電泳條件； 2、用一種對(duì)磷酸化與否均可顯色的蛋白進(jìn)行免疫印跡； 3、Photoshop計(jì)算扣除本底后的累計(jì)密度比值； 4、電泳區(qū)帶定量 原理：蛋白子發(fā)生磷酸化，其分子量可能發(fā)生變化，從而： 某些蛋白或位點(diǎn)磷酸化：區(qū)帶上移: CDK1(cdc2); 某些蛋白或位點(diǎn)磷酸化：區(qū)帶變化不大； 某些蛋白或位點(diǎn)磷酸化：區(qū)帶下移: CDK2 （聲明：“細(xì)胞之邦”微信平臺(tái)轉(zhuǎn)載并注明自其它來源的資訊，目的在于傳遞更多信息，并不代表本平臺(tái)贊同其觀點(diǎn)或證實(shí)其內(nèi)容的真實(shí)性，不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。） |
|
|
