本文為《中國醫(yī)學論壇報》為“2016年歐洲肺癌大會（ELCC 2016）”特別策劃。

中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院王潔教授應邀在ELCC 2016上以“基于血液樣本檢測T790M的先進技術（Advancing technology on blood based testing for detection of T790M）”為題進行了報告。在接受本報記者采訪時，王潔教授對其報告內容進行了介紹，該報告的內容主要關于涉及外周血EGFR突變檢測的背景、T790M的檢測技術和最佳檢測方法的探討以及當前的挑戰(zhàn)等3個方面。

圖 王潔教授在ELCC 2016作報告

• 外周血進行EGFR突變檢測的背景

對于腫瘤患者而言，外周血循環(huán)腫瘤細胞以及游離腫瘤DNA(ctDNA)可一定程度上反映腫瘤的遺傳學特征，而且無創(chuàng)、易獲得。循環(huán)腫瘤細胞（CTC）是轉移的必經(jīng)之路，因系完整的細胞，不僅可進行基因組學、轉錄組學和免疫表型的研究，亦可進行單細胞的基因和拷貝數(shù)差異研究及CTC培養(yǎng)和CDX模型研究。

但目前CTC捕獲技術尚在探索與優(yōu)化中，難以常規(guī)應用于臨床。而外周血中來源于壞死、凋亡腫瘤細胞或外泌體的DNA碎片被稱為循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），能在一定程度上克服局部穿刺組織的時間和空間異質性，更好地反應整個腫瘤的遺傳學特性，同時其獲取簡單、能實時檢測和監(jiān)測驅動基因、尤其耐藥相關基因變異的特點，且價格低廉，相較于CTC 更可能廣泛用于臨床實踐。近年諸多研究評價了血漿ctDNA用于驅動基因突變檢測的臨床可行性，其中研究最多且最可能用于臨床實踐的是EGFR突變檢測。目前多項研究結果顯示，外周血進行EGFR突變檢測，與組織標本的一致性約為70%～85%，敏感性為60%～85%，特異性為92%～100%。

小結 在臨床實踐中，對患者進行重復活檢并不容易，并且有10%～20%的患者活檢樣本不能提供足夠量的組織進行分子學檢測；而基于外周血的微創(chuàng)檢測方法可以對ctDNA動力學和耐藥的發(fā)生進行動態(tài)監(jiān)測，還可能捕捉到腫瘤異質性的信息。盡管ctDNA在血液中的濃度低（晚期腫瘤患者血漿中的濃度為17ng/ml），所占比例也低，為0.01%～93%，但隨著檢測技術的不斷發(fā)展，目前已有敏感性高、可以定量的檢測技術應用于臨床研究和實踐。

• T790M的檢測技術和最佳檢測方法的探討

EGFR敏感突變NSCLC的獲得性耐藥機制表現(xiàn)復雜、多樣（如上圖），因此，必須對耐藥進行動態(tài)檢測；其中，T790M突變在EGFR-TKI獲得性耐藥中占50%～60%。所以，檢測是否存在T790M突變對于指導EGFR敏感突變NSCLC患者的治療非常重要。當前，組織樣本的檢測技術有望用于血漿ctDNA的檢測（如下圖）。

數(shù)字化PCR法

數(shù)字化PCR法是核酸分子的絕對定量技術，已有研究顯示，對血漿樣本EGFR突變檢測的敏感性高達91.7%。數(shù)字PCR既能定量、也能定性，其檢測基因突變的特異性高。

YOSHITAKA SEKI等報告（Oncologist 2016，21:156–164），T790M突變狀態(tài)在ctDNA與再活檢腫瘤組織之間的相似率為0.8，敏感性為71%；T790M突變cfDNA片段隨著治療發(fā)生變化，并且在對TKI產(chǎn)生獲得性耐藥的患者之間也不同。Oxnard GR等報告［ Clin Cancer Res 2014 Mar 15，20(6):1698-705］，通過微滴數(shù)字PCR（ddPCR）動態(tài)監(jiān)測敏感和耐藥EGFR突變，具有高敏感性和精確的定量結果（如下圖）。

BEAMing法

BEAMing數(shù)字PCR檢測是結合了磁珠法乳濁液擴增和流式細胞術的一項技術，靈敏性高（可達0.02%），而且能對腫瘤DNA分子突變進行定量。

COBAS法

COBAS EGFR突變檢測是一種可用于組織或血漿樣本的定性檢測方法，可以發(fā)現(xiàn)EGFR基因外顯子18-21中的42個突變，目前已被FDA批準用于NSCLC患者T790M的檢測以選擇應用osimertinib的合適患者人群。

Sorensen BS等人的一項研究［ Cancer2014 Dec 15;120(24):3896-901］顯示，定期隨訪時進行COBAS法 對血樣EGFR突變進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)T790M突變的時間比臨床出現(xiàn)進展提前15～344天。

下一代測序（NGS）

美國耶魯大學癌癥中心2014年發(fā)布的一項研究顯示，對于EGFR突變的晚期肺腺癌患者，應用NGS檢測ctDNA中EGFR敏感和耐藥突變與腫瘤活檢組織具有高度的一致性，使得不通過有創(chuàng)的活檢就可早期發(fā)現(xiàn)靶向治療患者的耐藥。Newman AM等（Nature Med 2014）報告，NGS檢測的范圍可低至0.01%；在Ⅰ期腫瘤和Ⅱ～Ⅳ期腫瘤中，敏感性分別為50%、100%，并且特異性均為96%；減少了隨機噪聲和生物學變異可能帶來的影響。目前美國NGS的檢測成本已降至1000美金，成為經(jīng)濟可行的檢測方法指日可待。 

小結 與非數(shù)字PCR技術相比，基于數(shù)字PCR的技術顯示了較高的敏感性，但數(shù)字PCR分析僅能檢測一種已知的基因突變，而NGS能同時監(jiān)測多個基因突變，并且在全基因序列中可發(fā)現(xiàn)新的功能基因突變。因此數(shù)字PCR繼之NGS技術或許可以代表一種用于動態(tài)監(jiān)測耐藥的新型無創(chuàng)性血漿基因分型策略。

•  當前的挑戰(zhàn)

確定分子耐藥的閾值（cut-off value）以促進抗耐藥策略從治療向預防的發(fā)展

當前的抗EGFR-TKI耐藥策略是患者靶向治療臨床進展后再考慮使用第三代TKI。而將來預防耐藥的策略將是在EGFR-TKI治療過程中，定期進行液體活檢監(jiān)測，一旦T790M突變達到某一閾值而臨床尚未出現(xiàn)進展，即開始進行三代EGFR-TKIs治療，這樣的抗耐藥策略有可能延緩臨床進展時間，延長患者生存期。

探索第三代TKI的耐藥機制

動態(tài)、定量和多基因檢測體系的建立并應用于臨床將有助于明確第三代EGFR-TKI的耐藥機制。

將來的方向：基于液體活檢的動態(tài)監(jiān)測，從動態(tài)血漿樣本的外顯子測序中，發(fā)現(xiàn)與治療相關的基因突變的變化。 

總結

基于外周血ctDNA和CTC的實時、定量、動態(tài)多基因檢測是肺癌精準治療的基石。目前大多數(shù)外周血T790M突變檢測技術的敏感性為0.01%-0.1%。對單一T790M突變而言，BEAMing/ddPCR及Cobas或為理想的定量及定性方法；對耐藥后的多基因定量檢測，NGS是更好的選擇，怎樣標化和優(yōu)化NGS的檢測技術及建立標準化生物信息分析體系是未來其能否臨床常規(guī)應用的關鍵。

（采寫：《中國醫(yī)學論壇報》許景紅；審核：中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院 王潔教授）