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在轉(zhuǎn)錄組高通量測序數(shù)據(jù)分析過程中，主要就是轉(zhuǎn)錄本的構(gòu)建（拼接）及表達(dá)水平的衡量，其次還包括可變剪接之類的轉(zhuǎn)錄后修飾等研究分析。因此，做過RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析的童鞋們一定使用過或至少聽說過Cufflinks這個軟件。 Cufflinks是加利福尼亞大學(xué)伯克利分校數(shù)學(xué)和計算機(jī)生物實驗室，由LiorPachter領(lǐng)導(dǎo)的StevenSalzberg’s團(tuán)隊，和馬里蘭大學(xué)生物信息和計算機(jī)生物中心的Steven Salzberg小組，以及加州理工學(xué)院的Barbara Wold實驗室聯(lián)合作用的結(jié)果。Cufflinks 利用Tophat比對的結(jié)果（alignments）來組裝轉(zhuǎn)錄本，估計這些轉(zhuǎn)錄本的豐度，并且檢測樣本間的差異表達(dá)及可變剪接。這個軟件其實是個套裝，包括四個部分分別命名為：cufflinks、cuffcompare、cuffmerge及cuffdiff。 tophat-->Cufflinks-->cuffdiff轉(zhuǎn)錄組分析大致流程如下： 第一步，利用tophat/bowtie比對結(jié)果（bam格式）及參考基因組構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本，最終的轉(zhuǎn)錄本是以gtf格式保存的。 第二步，Cuffcompare主要是對兩個或多個轉(zhuǎn)錄本集合中轉(zhuǎn)錄本相似情況的比較，例如將第一步構(gòu)建出的轉(zhuǎn)錄本與ENSEMBL數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，評估轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建情況，此外，根據(jù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄本與已知ENSEMBL數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄本的相對位置定義了一系列分類，例如內(nèi)含子區(qū)域、反義、基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄本等等近10種分類。 第三步，cuffmerge是將多個轉(zhuǎn)錄本集合合并成一套轉(zhuǎn)錄本集合，例如將在多個組織樣本中構(gòu)建的多套轉(zhuǎn)錄本合并成一套轉(zhuǎn)錄本，cuffmerge能夠很好地完成去除冗余。 第四步，cuffdiff衡量兩個或多個樣本間差異表達(dá)的基因，例如癌癥與正常組織間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，此外還能衡量差異可變剪接體。 至此，轉(zhuǎn)錄本測序常規(guī)數(shù)據(jù)分析基本結(jié)束，接下來進(jìn)行實驗驗證或深入數(shù)據(jù)分析。 OK，如果對cufflinks的流程理解沒問題的話，現(xiàn)在問題來了??！ 在tophat-->cufflinks --> cuffdiff流程中，第一步對每一個樣本會產(chǎn)生一個的gtf格式的轉(zhuǎn)錄本，因此若有n個樣本就會有n個gtf. 但是在對n個樣本之間做差異表達(dá)分析時，由于各樣本之間的轉(zhuǎn)錄本集合不相同。在做cuffdiff時，卻要求輸入一個gtf，以便對該gtf 文件中轉(zhuǎn)錄本在不同樣本間進(jìn)行差異分析。因此需要將n個樣本的gtf文件合并成一個。問題是，cufflinks有cuffcompare和cuffmerge兩個合并轉(zhuǎn)錄本的方法， 這是應(yīng)該選用那個？這兩個有什么區(qū)別？ 個人理解及經(jīng)驗分享： 這是所有初做NGS分析的很因惑的問題，事實上，對于多個樣本構(gòu)建的多套轉(zhuǎn)錄本，如何得到統(tǒng)一的一套轉(zhuǎn)錄本，有下面三種方法： 1 在轉(zhuǎn)錄本拼接之前，把各樣本的比對bam文件合并，然后用合并的bam跑cufflinks 2 每個樣本的比對bam文件分別單獨跑cufflinks，各樣本的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建后，再用cuffcompare合并為一套轉(zhuǎn)錄本。 3 每個樣本的比對bam文件分別單獨跑cufflinks，各樣本的轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建后，再用cuffmerge合并為一套轉(zhuǎn)錄本。 這三種做法區(qū)別在于： 第一種方法流程相對簡單，所有的工作都拋給cufflinks一人完成，你都不需要知道cuffmerge、cuffcompare的用法。貌似是種完美解決方案。但很大的問題是：cufflinks能處理得了最終合并的bam嗎？對于小物種的樣本還可以，但對于人，若是7，8個樣本合成的bam，cufflinks吃不銷！ 第二和三種方法是類似的，都是在保留可變剪切結(jié)構(gòu)的前提下，將轉(zhuǎn)錄本合并。不同的是，cuffcompare只有A、B兩條轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)相同的時候，才將A、B合并。而cuffmerge是A、B某些部分互相overlap，就將它倆合并。事實上，cuffmerge再做合并的時候，是把overlap的transfrag重新調(diào)用了cufflinks，合成一個transfrag。 第二和三種方法還有一個很大的不同是，cuffmerge可以帶上參考注釋有參考的進(jìn)行合并，而cuffcompare不能如此。這是cuffmerge對cuffcompare的一個優(yōu)勢。 因此，我認(rèn)為第三種方法比第二種方法是最接近于第一種方法，而第一種方法的可實現(xiàn)性較差，在現(xiàn)有條件，最完美的解決方案就是第三種方法：每個bam單獨跑cufflinks，跑完的結(jié)果再用cuffmerge合并。 |
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