近年來，作為一種神經(jīng)保護(hù)藥的紅細(xì)胞生成素（erythrop oietin，EPO）成為研究熱點(diǎn)。EPO 是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為 30×10³（30 kD）的熱（80℃）穩(wěn)定性糖蛋白。外周 EPO 的相對(duì)分子質(zhì)量為 35 kD，而腦源性 EPO 為 33 kD，兩者的差異可能與腦源性 EPO 的低唾液酸化有關(guān)。EPO 及其受體的表達(dá)見于多種組織。大量基礎(chǔ)和小樣本臨床試驗(yàn)均顯示，EPO 具有神經(jīng)保護(hù)作用。研究證實(shí)，EPO 與其受體結(jié)合后，可引起受體二聚化，激活下游多條通路，最終改變促凋亡 / 凋亡蛋白的比例，發(fā)揮抗凋亡作用；抑制炎性因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用；抑制自由基生成引起的氧化毒性；通過促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)血管和神經(jīng)發(fā)生；通過減少谷氨酸釋放并增加重?cái)z取，對(duì)抗興奮性氨基酸毒性；降低缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的血腦屏障（brain-blood barrier，BBB）破壞性物質(zhì)的表達(dá)，減輕 BBB 損傷；對(duì)新生兒腦缺血缺氧也具有很好的保護(hù)作用。

迄今為止，EPO 的研究主要集中在 4 個(gè)方面：（1）具體的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制；（2）給藥途徑；（3）最佳劑量和時(shí)間窗；（4）不良反應(yīng)和 3 種衍生物。盡管對(duì)其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但 Souvenir 等認(rèn)為 EPO 研究很少能進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，因其詳細(xì)機(jī)制不明，而且通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子也不確定。很多實(shí)驗(yàn)研究對(duì) EPO 的藥代學(xué)特性、最佳時(shí)間窗及最佳劑量進(jìn)行了探索。一項(xiàng)匯總分析顯示，早期（6h 內(nèi)）大劑量應(yīng)用 EPO 可顯著改善腦缺血模型動(dòng)物的預(yù)后，但至今仍無動(dòng)物或人的 EPO 量效曲線。長(zhǎng)期大量外周應(yīng)用，可因促進(jìn)紅細(xì)胞過量生成而出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此已研發(fā)出多種 EPO 衍生物，如氨基甲酰化 EPO（carbamy lated EPO，CEPO）、乏唾液酸基 EPO（asialoerythropoietin，asialo-EPO）、少唾液酸的重組人 EPO[ 即神經(jīng)元 EPO（neu-ronal EPO， Neuro-EPO）]。一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們與一般 EPO 效果相同，但另一些研究則顯示這 3 種衍生物的受體不同于 EPO，缺乏促進(jìn)血管發(fā)生和保護(hù) BBB 完整性的作用，因此效果不如 EPO。2008 年，在德國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)顯示，在重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissueplasminogen activator，rtPA）靜脈溶栓后使用 EPO，缺血性卒中患者的病死率增高。

面對(duì) EPO 研究結(jié)果的不一致，現(xiàn)重點(diǎn)對(duì) EPO 在腦缺血神經(jīng)保護(hù)的基礎(chǔ)和臨床研究中存在的問題進(jìn)行綜述，以促進(jìn) EPO 的進(jìn)一步研究。

1 基礎(chǔ)研究

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Jerndal 等對(duì) 19 項(xiàng)基礎(chǔ)研究進(jìn)行分析后認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)研究多采用正常動(dòng)物，且多數(shù)僅進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，只有 7.5% 采用的是高血壓動(dòng)物并進(jìn)行了神經(jīng)功能評(píng)分，因此不能很好地模擬臨床；同時(shí)，很多基礎(chǔ)研究未進(jìn)行合理的偏倚控制，因此有可能夸大 EPO 的效果。Lapchak 也提出，現(xiàn)有 EPO 基礎(chǔ)研究質(zhì)量不高，可能夸大了其安全性和療效。

1.2 給藥途徑

BBB 是藥物進(jìn)出腦組織的重要門戶，其特征性結(jié)構(gòu)是跨膜蛋白及黏附分子構(gòu)成的緊密連接。藥物的生化特性決定了其運(yùn)輸方式，相對(duì)分子質(zhì)量＞0.6 kD 的脂溶性藥物幾乎不能通過 BBB，作為水溶性藥物的 EPO 通透性更低。有報(bào)道顯示，外周應(yīng)用 EPO 可在腦內(nèi)達(dá)到足夠的治療濃度，但需較大劑量。因此，后續(xù)研究采用了很多給藥方式，如構(gòu)建各種 EPO 融合蛋白、經(jīng)鼻給藥、腦內(nèi)和腦室內(nèi)給藥等，但其中的一些方法在臨床實(shí)踐中并不可行。

盡管大分子物質(zhì)很難通過 BBB，但腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上存在很多大分子物質(zhì)（如轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子）的受體，因此可通過受體介導(dǎo)進(jìn)入腦組織。Brines 等首次證實(shí)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞上也存在大量 EPO 受體，EPO 可通過受體介導(dǎo)進(jìn)入腦內(nèi)而發(fā)揮作用。很多實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了可介導(dǎo) EPO 進(jìn)入腦內(nèi)的融合蛋白。例如，將人 EPO 重新設(shè)計(jì)為 IgG-EPO 融合蛋白，其中 IgG 部分為抗人胰島素受體（insulin receptor，HIR）單克隆抗體（monoclonal antibody，MAb），整個(gè)融合蛋白即為 HIRMAb-EPO；將 EPO 融合至小鼠抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）嵌合 MAb 的重鏈設(shè)計(jì)成轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單抗 -EPO，即 cTfRMAb-EPO。研究顯示，大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠靜脈注射后，這 2 種融合蛋白均能很好地通過 BBB；免疫組化染色和神經(jīng)功能評(píng)分均顯示，其神經(jīng)保護(hù)作用顯著優(yōu)于 EPO，且在外周循環(huán)中的濃度很低，不良反應(yīng)也很少。Zhang 等通過將來自人免疫缺陷病毒的 TAT 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)序列連接到 EPO 設(shè)計(jì)出一種融合蛋白 EPO-TAT，其通過 BBB 的能力顯著提高，腹腔和靜脈注射后腦組織內(nèi)濃度分別為 EPO 的 2 倍和 5 倍。雖然業(yè)已證實(shí)很多融合蛋白可更好地通過 BBB 而發(fā)揮作用，但目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，其安全性仍有待進(jìn)一步研究。

有學(xué)者認(rèn)為，卒中后 BBB 破壞是 EPO 進(jìn)入腦組織的主要原因。MRI 研究顯示，動(dòng)物腦缺血再灌注后的 BBB 通透性改變呈雙相，第 1 期為再灌注后 4～5 h，第 2 期為 48 h，但卒中患者是否存在類似的特征尚不清楚。卒中后 BBB 通透性增加具有時(shí)間和空間異質(zhì)性，影響因素包括缺血類型、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間，因此依賴于 BBB 破壞導(dǎo)致的通透性增加存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。另外，EPO 本身可保護(hù) BBB 的完整性，自身通過率也會(huì)降低；外周大劑量應(yīng)用可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；某些 EPO 衍生物（如 Neuro-EPO）的半衰期僅為數(shù)分鐘，因此需要尋找其他高效的給藥途徑。雖然 EPO 基礎(chǔ)研究已對(duì)多種給藥方式，如經(jīng)鼻腔給藥、腦內(nèi)及腦室內(nèi)給藥等進(jìn)行了探討，但目前均處于實(shí)驗(yàn)研究階段。

嗅上皮含有很多雙極神經(jīng)元，其軸突形成神經(jīng)束通過篩板入腦內(nèi)。因此，EPO 經(jīng)鼻應(yīng)用可繞過 BBB，避免了外周不良反應(yīng)和被肝臟清除，并且快速高效。經(jīng)鼻給藥涉及 2 種轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制：（1）藥物通過內(nèi)吞進(jìn)入嗅上皮初級(jí)神經(jīng)元，然后經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入嗅球；（2）藥物經(jīng)細(xì)胞旁途徑跨嗅上皮層快速吸收，然后進(jìn)入腦內(nèi)。Hermann 認(rèn)為，嚙齒類及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物 EPO 經(jīng)鼻用藥后會(huì)很快出現(xiàn)在腦脊液內(nèi)，提示其并非通過軸漿運(yùn)輸進(jìn)入腦內(nèi)，具體機(jī)制不明。實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)鼻和腹腔注射給予同樣劑量的 EPO 時(shí)，前者效果更好；當(dāng)通過 2 種給藥途徑的療效同樣時(shí)，則前者的血液學(xué)不良反應(yīng)較輕。Gao 等對(duì)永久性腦缺血沙土鼠經(jīng)鼻應(yīng)用 EPO 的研究顯示，EPO 組動(dòng)物死亡率顯著降低，而且感覺運(yùn)動(dòng)功能有所改善，表明經(jīng)鼻應(yīng)用 EPO 是一種有效的治療手段；腦缺血后 10～60 min 是經(jīng)鼻應(yīng)用 EPO 的最佳時(shí)間，1～3 d 后給藥效果較差。然而，人經(jīng)鼻給藥的效率并不高，因?yàn)槿诵嵘掀じ采w率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于嚙齒類動(dòng)物（3%～5% 對(duì) 50%），而且腦脊液容積和更新率也存在很大差異。EPO 經(jīng)鼻腔進(jìn)入后，首先聚集在嗅球投射區(qū)，主要在前腦基底部，距缺血區(qū)的距離很遠(yuǎn)。雖然研究顯示 EPO 經(jīng)鼻應(yīng)用數(shù)分鐘后即可在猴腦脊液中檢測(cè)到，但并未檢測(cè)受損區(qū) EPO 濃度是否達(dá)到治療濃度。腦脊液與腦組織之間無接觸限制，分子可自由通過，很多研究證實(shí)腦室內(nèi)注射 EPO 的保護(hù)效果良好。Zhang 等報(bào)道，四血管閉塞模型大鼠腦室內(nèi)應(yīng)用 EPO，可增加 Akt 及其底物糖原合酶激酶磷酸化以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生成，從而在腦缺血時(shí)具有保護(hù)作用；EPO 腦室內(nèi)給藥的時(shí)間窗為缺血前 20 h 及后 20 min 內(nèi)，1 h 后則無保護(hù)作用。Sakanaka 等將 EPO 注入腦缺血沙土鼠側(cè)腦室發(fā)現(xiàn)，海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元損傷顯著減輕，動(dòng)物認(rèn)知能力顯著改善。不過，腦室內(nèi)給藥后藥物仍需擴(kuò)散方能到達(dá)損傷部位，且腦脊液的快速更新可能會(huì)降低注射藥物的利用度，因此不適用于急性期治療。另外，腦和腦室內(nèi)給藥存在以下缺點(diǎn)：（1）為有創(chuàng)性操作，可能導(dǎo)致并發(fā)癥；（2）注入后仍需在腦組織中繼續(xù)擴(kuò)散，受藥物分子量和組織特性的影響；（3）腦內(nèi)組織的可擴(kuò)張性限制了注入藥量。

1.3 最佳劑量及時(shí)間窗

與其他神經(jīng)保護(hù)藥，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素類、腫瘤壞死因子等一樣，EPO 僅在一定濃度范圍內(nèi)起保護(hù)作用，過低或過高均無效或有害。至今尚無嚙齒類動(dòng)物和人 EPO 外周應(yīng)用的量效曲線。實(shí)驗(yàn)研究表明，外周應(yīng)用 EPO 后在未損傷小鼠腦組織中達(dá)峰時(shí)間為 3h，半衰期為 5～6 h。新生大鼠 MCAO 模型實(shí)驗(yàn)顯示，立即給予單次劑量 EPO 并不能縮小梗死體積，而 3 次給藥可縮小梗死體積并減輕神經(jīng)功能缺損，提示 EPO 多次用藥的效果優(yōu)于單次給藥，但最佳時(shí)間間隔和單次劑量未知。不少研究顯示，EPO 在腦梗死后 6h 內(nèi)外周應(yīng)用具有很好的保護(hù)作用。一項(xiàng)匯總分析顯示，及早（6 h 內(nèi)）大劑量應(yīng)用 EPO 可縮小梗死體積和改善功能轉(zhuǎn)歸。然而，Siren 的研究表明，在腦缺血后 3h 內(nèi)靜脈應(yīng)用 EPO 可挽救大部分缺血神經(jīng)元，而 6h 時(shí)應(yīng)用僅能挽救少數(shù)神經(jīng)元。因此，EPO 外周應(yīng)用的最佳劑量及最佳時(shí)間窗爭(zhēng)議很大，需要繼續(xù)研究。

1.4 不良反應(yīng)和 3 種衍生物

長(zhǎng)期外周大劑量應(yīng)用 EPO 可產(chǎn)生嚴(yán)重的血液學(xué)不良反應(yīng)，而使用 EPO 衍生物則可避免。Neuro-EPO 不含內(nèi)源性 EPO 具有的修飾成分，可能更適合人體，但半衰期僅為數(shù)分鐘，因此只能選擇局部給藥。盡管有關(guān) EPO 的機(jī)制有很多研究，但具體和確切的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚不完全清楚，而 3 種衍生物的受體及通路是否有其獨(dú)特性更是知之甚少。研究顯示，EPO 發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的受體不同于促紅細(xì)胞生成作用的受體，這種獨(dú)特的受體由 EPO 受體及 CD131（又稱β共同受體）構(gòu)成，與 EPO 的親和力很低，3 種 EPO 衍生物均通過其發(fā)揮作用。Wang 等的研究證實(shí)，EPO 和 CEPO 均可具有神經(jīng)保護(hù)作用，但 EPO 組可顯著增高紅細(xì)胞比容，而 CEPO 組紅細(xì)胞比容則無顯著改變，表明 CEPO 無血液學(xué)不良反應(yīng)。Villa 等指出，3 種 EPO 衍生物可降低髓過氧化物酶、CD68、GFAP、Tau-1、半暗帶小膠質(zhì)細(xì)胞激活以及多形核白細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕白質(zhì)損傷，縮小最終梗死體積。Lapchak 認(rèn)為，CEPO 的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與形態(tài)發(fā)生素和 Sonic HedgeHog 有關(guān)。雖然長(zhǎng)期大量. 外周應(yīng)用 EPO 衍生物不會(huì)產(chǎn)生血液學(xué)不良反應(yīng)，但經(jīng)典的 EPO 可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的 EPO 受體，從而降低 BBB 通透性和促進(jìn)血管生成，而這 3 種衍生物可能并不存在這些效應(yīng)。

2 臨床研究

2002 年，Ehrenreich 等首次在 53 例缺血卒中患者中靜脈應(yīng)用 EPO（3.3×10⁴ IU）證實(shí) EPO 安全有效，能顯著改善卒中發(fā)病后 1 個(gè)月時(shí)的神經(jīng)功能轉(zhuǎn)歸。之后，在德國(guó)進(jìn)行了一項(xiàng)多中心大樣本臨床Ⅱ/Ⅲ期試驗(yàn)，在 522 例急性大腦中動(dòng)脈供血區(qū)梗死患者 rtPA 靜脈溶栓后 6h、24 h 或 48 h 時(shí)應(yīng)用 EPO，結(jié)果顯示，EPO 非但不能改善卒中發(fā)病后 90 d 時(shí)的 Barthel 指數(shù)，反而會(huì)增高病死率（EPO 組為 16.4%，對(duì)照組為 9%）。雖然病死率增高的具體機(jī)制未知，但至少說明接受 rtPA 治療的缺血性卒中患者不宜應(yīng)用 EPO，之后的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)開始研究其中的機(jī)制。Jia 等對(duì)大鼠 MCAO 后 2h 和 6h 聯(lián)合應(yīng)用 EPO（腹腔注射）和 rtPA（靜脈注射）的效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，缺血后 2h 聯(lián)合應(yīng)用可顯著縮小梗死體積，而且不會(huì)增高出血性轉(zhuǎn)化發(fā)生率，但缺血后 6h 應(yīng)用則不能減輕腦損傷并可增高腦出血風(fēng)險(xiǎn)；免疫組化染色顯示，缺血后 6h 聯(lián)合用藥引起的基質(zhì)金屬蛋白酶 -9/ 核因子 -κB/ 白細(xì)胞介素受體 -1 相關(guān)激酶的上調(diào)可能是腦出血風(fēng)險(xiǎn)增高的原因。Zechariah 等也證實(shí)，EPO 可增加小鼠 MCAO 經(jīng) rtPA 治療后的 BBB 通透性、細(xì)胞外基質(zhì)降解和 DNA 破壞。

面對(duì) EPO 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究中出現(xiàn)的問題，很多專家提出了自己的觀點(diǎn)。Hermann 認(rèn)為，EPO 不能應(yīng)用于 rtPA 溶栓患者，并不意味著 EPO 不能應(yīng)用于臨床，因?yàn)榛A(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明 EPO 即使在急性期后應(yīng)用仍有強(qiáng)大的促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)作用，因此建議進(jìn)行嚙齒類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物神經(jīng) EPO 組織濃度比較的研究，從而指導(dǎo) EPO 臨床試驗(yàn)的劑量選擇。Digicaylioglu 也持相同觀點(diǎn)，認(rèn)為 EPO 的相對(duì)安全性（早已應(yīng)用于貧血治療）以及目前缺乏有效神經(jīng)保護(hù)藥的現(xiàn)狀迫使我們繼續(xù)進(jìn)行 EPO 的保護(hù)作用研究。另外還指出，已有研究在給藥途徑、劑量、動(dòng)物模型制作以及結(jié)果評(píng)價(jià)方面存在很大異質(zhì)性，因此未來的神經(jīng)保護(hù)藥研究應(yīng)嚴(yán)格遵守現(xiàn)有的卒中治療學(xué)術(shù)工業(yè)圓桌會(huì)議（Stroke Therapy Academic Industry Roundtable，STAIR）指南。由于目前研究的異質(zhì)性以及量效曲線的缺乏，德國(guó)臨床試驗(yàn)的陰性結(jié)果并不成熟，在未來應(yīng)采用新的參數(shù)和方法進(jìn)行進(jìn)一步的研究。Lapchak 則認(rèn)為，鑒于 EPO 在德國(guó)臨床試驗(yàn)中的有害作用，應(yīng)在栓塞性卒中模型中嚴(yán)格評(píng)價(jià) EPO 的安全性，以降低試驗(yàn)失敗可能性和對(duì)患者的危害性。

EPO 早已應(yīng)用于貧血的臨床治療，后來發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)保護(hù)作用，開始了至今 20 多年的 EPO 神經(jīng)保護(hù)研究。EPO 在基礎(chǔ)和臨床研究中存在很多問題，不能確切證明其作用。因此，應(yīng)嚴(yán)格遵照 STAIR 指南的規(guī)定繼續(xù)進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究。