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熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交技術(shù)(florescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)是一種利用熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)。它將熒光信號(hào)的高靈敏度、安全性及直觀性和原位雜交的高特異性結(jié)合起來，通過熒光標(biāo)記的核酸探針與待測樣本核酸進(jìn)行原位雜交。在熒光顯微鏡下對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù)，從而對(duì)染色體或基因異常的細(xì)胞和組織樣本進(jìn)行檢測和診斷，為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。自20世紀(jì)80年代末，Pinkel和Heiles將FISH技術(shù)引入染色體檢測領(lǐng)域以來，F(xiàn)ISH技術(shù)在臨床診斷及科研工作中得到廣泛運(yùn)用，并顯示出比傳統(tǒng)技術(shù)的顯著優(yōu)勢性。1986年．Dilla等首次用熒光素直接標(biāo)記DNA探針檢測人特異性染色體。接著Pinkel等利用生物素標(biāo)記DNA探針，建立了間接熒光原位雜交技術(shù)，這一技術(shù)放大了雜交信號(hào)。提高了FISH的敏感性。此后，地高辛和二硝基苯酚等標(biāo)記物以及各種不同顏色熒光素在FISH技術(shù)中被廣泛利用，不斷完善了該技術(shù)的信號(hào)檢測系統(tǒng)。PCR技術(shù)與FISH的巧妙結(jié)合，不僅提高了制備探針的能力，也提高了該方法的敏感性，可用于鑒定任一目的基因在染色體中的定位。計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)在FISH中的應(yīng)用極大地提高了FISH技術(shù)的敏感性以及結(jié)果的直觀性和可信度。FISH技術(shù)還可與流式細(xì)胞術(shù)、染色體顯微切割等技術(shù)結(jié)合使用，使該技術(shù)不僅用于細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究，也越來越廣泛地應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)研究、遺傳病基因診斷等臨床醫(yī)學(xué)研究中。 FISH有直接法和間接法兩種。直接法是用已知堿基序列的特異DNA片段作為探針，并標(biāo)記上不同熒光素，在組織切片、間期細(xì)胞及染色體標(biāo)本上與靶核酸進(jìn)行DNA-DNA原位雜交。因所形成的雜交體帶有熒光素。故可在熒光顯微鏡下直接觀察。常用的熒光素有異硫氰酸熒光素(FITC)、得克薩斯紅(Texasred)、羅丹明(rhodamine)及其衍生物四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRIT)等。該方法簡單快捷，但信號(hào)較弱．敏感性較低。間接法使用非熒光物質(zhì)標(biāo)記的探針。如生物素或地高辛等標(biāo)記探針，再通過親和連接或免疫反應(yīng)帶人熒光物質(zhì)來檢測雜交體的存在。因?yàn)橛须s交信號(hào)放大作用，從而增加了雜交的敏感性。也降低了實(shí)驗(yàn)成本。故間接法FISH是目前使用較多的方法。 FISH實(shí)驗(yàn)操作與用非熒光標(biāo)記探針的原位雜交基本相似。在組織 準(zhǔn)備方面，以新鮮組織、冷凍組織樣本、細(xì)胞涂片、培養(yǎng)細(xì)胞爬片及中期染色體等材料進(jìn)行FISH的結(jié)果優(yōu)于石蠟包埋組織樣本的雜交效果。由于FISH是DNA-DNA原位雜交，故在雜交前的變性處理頗為重要。 近年來。在FISH技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子遺傳學(xué)新技術(shù)不斷出現(xiàn)，如多色FISH技術(shù)、染色質(zhì)纖維熒光原位雜交(chromatin fiber FISH)和DNA纖維熒光原位雜交(DNA fiber FISH)技術(shù)等。多色FISH通過選用多種具有可分辨光譜的熒光染料與不同的探針結(jié)合(直接法)，在一個(gè)染色體中期分裂象或細(xì)胞核中可呈現(xiàn)多種顏色標(biāo)記，同時(shí)檢測多種染色體異常。如許多用染色體涂片方法和G或Q顯帶技術(shù)無法檢測或難以確定的染色體異常，通過多色FISH技術(shù)可以揭示染色體畸變，并確定畸變的來源。此外，多色FISH對(duì)于復(fù)雜的染色體核型改變。尤其是實(shí)體瘤的染色體檢查具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。多色FISH也可采用三種或三種以上不同的標(biāo)記物。如生物素、地高辛和二硝基苯酚標(biāo)記探針，然后用不同顏色熒光素，如FITC(綠色)、羅丹明(紅色)和cascadeblue(藍(lán)色)標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測(間接法)，可同時(shí)得到多種不同顏色的熒光信號(hào)，這種方法可以在同一標(biāo)本上同時(shí)檢測多種DNA序列。 纖維FISH技術(shù)是將細(xì)胞的全部DNA在玻片上制備出高度伸展的染色質(zhì)DNA纖維，然后用標(biāo)記不同顏色熒光物質(zhì)的探針與DNA纖維進(jìn)行雜交，最后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并分析，若配合計(jì)算機(jī)圖像分析軟件使用，結(jié)果會(huì)更理想。纖維FISH技術(shù)可以快速直接目視判斷探針位置以及多個(gè)探針間的相對(duì)位置、物理位置和重疊程度等，因而大大加速了基因定位和人類基因組高分辨物理圖譜的繪制。 PRINS技術(shù)是將PCR和FISH技術(shù)聯(lián)合使用，先由寡核苷酸引物或變性DNA片段與細(xì)胞內(nèi)的靶DNA互補(bǔ)序列復(fù)性。在聚合酶的作用下，將熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸(如FITC―1l―dUTP)帶人新合成的DNA中。PRINS技術(shù)可用于檢測罕見的異染色質(zhì)變異體和評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞株的染色體異質(zhì)性。
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