今天，我們聊一聊FISH檢測技術(shù)，F(xiàn)ISH是魚嘛？FISH會發(fā)光？FISH的紅綠黃點是啥？是色彩斑斕的魚？

This FISH？（貓表示一臉懵逼）

首先，我們先了解下什么是FISH？

FISH：熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization， FISH），利用雜交的原理，用熒光染料標(biāo)記探針DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細(xì)胞核特定靶DNA序列雜交，然后通過熒光顯微鏡觀測熒光信號位置、大小及數(shù)量來判斷待測序列的缺失、擴增及易位等情況。

熒光原位雜交（FISH）

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)（放射性標(biāo)記探針靈敏度很高，能夠檢測小至幾百個堿基對的DNA序列，但是由于同位素的安全問題、半衰期、信號統(tǒng)計等限制了此項技術(shù)的廣泛應(yīng)用，后來逐漸發(fā)展出了非放射性標(biāo)記探針原位雜交技術(shù)：直接法（熒光素/其他染料）；間接法（地高辛/生物素））。它的基本原理是：如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。

FISH檢測的基本原理

常見五種FISH探針

關(guān)于FISH檢測的探針，一般分為間標(biāo)型探針和直標(biāo)型探針：

1，間標(biāo)型探針是指DNA探針先與某個半抗原連接，諸如生物素或地高辛，然后半抗原與熒光素基團連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團，類似“三明治”的復(fù)合物。

【生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），二硝基苯基（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探針標(biāo)記。前兩者較為常用，通常采用切口平移法或隨機引物法對探針標(biāo)記。如兩個不同的探針分別用Biotin和Digoxigenin標(biāo)記，雜交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分別與探針上的Biotin 和Digoxigenin結(jié)合，應(yīng)用雙色濾光片，在顯微鏡下就可以同時看見帶有綠色熒光的FITC和紅色熒光的Texas-Red信號。同理，采用三種或三種以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等標(biāo)記探針，然后用多種不同顏色的熒光素，如FITC（綠色），Rhodamine（紅色），AMA或Cascade Blue（藍(lán)色）等結(jié)合抗體進行檢測，可同時得到多種不同顏色的熒光信號，如采用不同的排列組合，最多可同時檢測7種不同的探針。】

2，直標(biāo)型探針是指DNA探針共價連接熒光素基團：近年來，Vysis 公司成功的生產(chǎn)些大片段的DNA探針（100-400kb）。由于探針較長故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進一步簡化，而且雜交信號更強。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點。隨著熒光染料和熒光檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測領(lǐng)域，尤其是在疾病分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計。

FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細(xì)胞染色體也可以是間期細(xì)胞，間期細(xì)胞可以是冰凍切片，也可以是細(xì)胞滴片或印片。任何熒光顯微鏡均可用于觀察FISH信號，但對單拷貝探針的信號需要質(zhì)量較好的熒光顯微鏡。

FISH技術(shù)一般用于了解基因或染色體發(fā)生擴增、缺失、融合或斷裂；樣本來源廣泛：組織、脫落細(xì)胞、羊水、血液、骨髓都可以檢測，且不僅限于新鮮樣本，2-3年的石蠟樣本都可以檢測；FISH檢測在分子檢測里是收費最低的而且很多地方FISH檢測都進入醫(yī)保可報銷范疇。

在FISH中最重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強度，因此探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬滅劑封片且避光保存；各種試劑pH也要精確達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。

目前FISH主要集中在DNA水平方面檢測，而針對RNA這塊比較困難，F(xiàn)ISH 技術(shù)作為連接分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)的橋梁地位已為世人所公認(rèn)。盡管目前FISH技術(shù)無法達(dá)到百分百完全雜交，特別是在應(yīng)用較短cDNA探針時存在雜交效率明顯下降的問題，但隨著各種新型分子探針以及更為精密高端的光學(xué)顯微鏡和功能強大的計算機分析系統(tǒng)的不斷問世，上述問題將會逐步得到解決。

目前通過FISH方法可以檢測各條染色體的靶標(biāo)接近300余種，能夠滿足臨床上大部分腫瘤及遺傳疾病的檢測需求，這還不包括一些用于科研的罕見基因靶標(biāo)。

目前主要用于指導(dǎo)靶向藥物的使用如赫賽汀（HER2）、克唑替尼（ALK/ROS1/CMET），腦膠質(zhì)瘤獨特類型（1p19q）等。

一般做FISH需要CEP探針，CEP檢測著絲粒，CEP探針作為基因特異探針的實驗對照，有其重要的意義。CEP探針也可獨立用于染色體檢測，可從總體上檢測染色體異常情況。

比如ALK-EML4基因FISH檢測：可設(shè)計兩個探針分別針對ALK和EML4，可檢測染色體2p23位點的ALK基因（NCBI GeneID:238）與染色體2p21位點的EML4基因（NCBI GeneID: 27436）間發(fā)生的染色體異常易位。也可以針對ALK設(shè)計一個探針，但是如果發(fā)生了融合，也不能確定是何種融合類型。（見下圖）

可以設(shè)計已知融合基因的探針，比如針對ALK和EML4的，ALK全部用紅色探針覆蓋，EML4用黃色探針覆蓋，正常就是紅黃分開，融合就是紅黃在一起。

可以設(shè)計已知融合基因的探針，比如針對ALK的，用紅色和黃色覆蓋ALK基因的上下游區(qū)域，正常就是紅黃在一起，融合就是ALK發(fā)生了斷裂就是紅黃分開了。

 比如EGFR基因FISH檢測：可用一個CEP07探針加一個EGFR基因探針，兩種探針的混合物，一種探針檢測EGFR基因，另一種檢測7號染色體的著絲點，可特異檢測位于7號染色體的EGFR基因（NCBI GeneID:1956）的異常擴增。

實例1：兩名乳腺癌患者，考慮是否使用曲妥珠單抗，對HER2基因擴增進行檢測。（FISH為HER2檢測的金標(biāo)準(zhǔn)）

HER2的FISH檢測

實例2：兩名非小細(xì)胞肺癌患者，考慮是否使用克唑替尼，對ALK融合基因進行檢測。

ALK的FISH檢測

對于FISH檢測結(jié)果的解讀，一般根據(jù)探針的要求，分為以下兩種：

1，數(shù)目探針：直接觀察基因標(biāo)記顏色進行計數(shù)確定數(shù)值或者平均拷貝數(shù)，根據(jù)不同探針說明書要求進行判斷，比如乳腺癌HER2基因有明確的指南，先看比值，再看拷貝數(shù)，有一些則是直接看比值。（比如HER2：計數(shù)20個細(xì)胞，HER2紅綠比值大于2，且 HER2拷貝數(shù)大于6，點狀擴增陽性；HER2信號成簇，綠色CSP17信號正常，直接判讀簇狀擴增）

2，結(jié)構(gòu)探針：先要明確異常信號模式，然后再計數(shù)各種異常信號的細(xì)胞個數(shù)占觀察區(qū)域總體細(xì)胞比例，再比對判讀標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。（比如ALK：計數(shù)20個細(xì)胞，出現(xiàn)1紅1綠1融合細(xì)胞比例>15%，判讀為陽性，如果比值接近15%，需要擴大計數(shù)范圍；未發(fā)生紅綠分離，但是出現(xiàn)了染色體多倍體，判讀為陰性）

FISH檢測技術(shù)點評

優(yōu)點：

1，安全、快速、靈敏度高；

2，探針能較長時間保存；

3，多色標(biāo)記，簡單直觀；

4，可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析；

5，可應(yīng)用于新鮮、冷凍或石蠟包埋標(biāo)本以及穿刺物和脫落細(xì)胞等多種物質(zhì)的檢測。

缺點：

1，不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時效率明顯下降；

2，沒辦法準(zhǔn)確判斷斷裂基因的具體坐標(biāo)位置，進一步判斷需要RNA seq來檢測。

此方法適宜于實驗室簡單快速的進行基因擴增、融合及拷貝數(shù)變異的檢測和評估。