自私基因元件（Selfish genetic element）對(duì)于原核生物（prokaryote）可不一定是一無(wú)是處的。我們都知道病毒可以通過(guò)重編程宿主細(xì)胞（reprogramming host cell）的方式進(jìn)行大量復(fù)制，也可以像“偷渡客”一樣整合到宿主細(xì)胞的基因組里潛伏起來(lái)伺機(jī)作亂；可接合質(zhì)粒（conjugative plasmid，又稱作轉(zhuǎn)移性染色質(zhì)外DNA）可以賦予宿主細(xì)胞新的優(yōu)勢(shì)特性，比如獲得某種抗毒素因子，這樣細(xì)胞就會(huì)像吸毒上癮一樣不愿意丟失這些質(zhì)粒，還有很多這類外來(lái)DNA賴在細(xì)菌等細(xì)胞中不走的事例這里就不一一介紹了。不過(guò)細(xì)菌（bacteria）和古細(xì)菌（archaea）都有一套防御機(jī)制抵御這種外來(lái)的侵入性因子，這種防御機(jī)制就是在成簇的、有規(guī)律間隔的多次重復(fù)短片段（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（adaptive immune system）。Jinek等人最新的研究成果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞里的CRISPR效應(yīng)酶蛋白Cas9因子不是通過(guò)一個(gè)RNA，而是一對(duì)小RNA分子來(lái)清除入侵的外源DNA片段。

CRISPR系統(tǒng)能夠?qū)⒏鞣N外源的病毒或質(zhì)粒DNA短片段“集中”到細(xì)胞基因組里某個(gè)特定的重復(fù)片段區(qū)域上，將這些外源DNA當(dāng)作細(xì)胞曾經(jīng)經(jīng)受過(guò)外源DNA入侵的一種記憶給儲(chǔ)存起來(lái)。然后這段DNA會(huì)轉(zhuǎn)錄生成CRISPR前體RNA（precursor CRISPR RNA），前體RNA生成之后會(huì)被切割成一段一段的重復(fù)RNA片段，這些小RNA分子就是成熟的CRISPR RNA（crRNA）。然后crRNA會(huì)招募CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）與各種被細(xì)胞記住的外源的入侵DNA或mRNA片段結(jié)合，將它們徹底摧毀。

科學(xué)家們是在大約5年前才開(kāi)始了解到CRISPR的，當(dāng)時(shí)他們發(fā)現(xiàn)如果將某種病毒的DNA片段摻入細(xì)菌之中，細(xì)菌就會(huì)對(duì)隨后再次感染的同種病毒產(chǎn)生極高的免疫力。細(xì)菌就是從之前入侵的病毒DNA片段那里認(rèn)識(shí)了這種病毒，從而獲得了免疫力，當(dāng)病毒再次入侵的時(shí)候細(xì)菌編碼的Cas9因子就可以發(fā)揮作用，消滅來(lái)犯的病毒。但是當(dāng)時(shí)還不清楚這種Cas9因子的具體作用機(jī)制。

科學(xué)家們首先需要解決的問(wèn)題就是搞清楚Cas9因子是如何獲得成熟的crRNA的。在大部分CRISPR-Cas系統(tǒng)里都少不了這樣一位主角，那就是將CRISPR前體RNA切割成一小段一小段小RNA分子的專一性核酶（nuclease）。除了成熟的crRNA之外，這些Cas9因子還需要另外一種CRISPR特異性的小RNA（CRISPR-specific small RNA）的幫助，我們把這種小RNA稱作反式激活的crRNA（tracrRNA），因?yàn)檫@種小RNA剛好與crRNA的小片段互補(bǔ)，同時(shí)它們還是RNA特異性的宿主核糖核酸酶RNase III的底物。經(jīng)過(guò)RNase III的切割之后，這一對(duì)互補(bǔ)的RNA（其中包括一條42bp的crRNA和一條75bp的tracrRNA）就可以充當(dāng)Cas9因子的向?qū)?，幫助它“打鬼子”了?/p>

Jinek等人就在此基礎(chǔ)之上繼續(xù)進(jìn)行了更深入的研究，他們發(fā)現(xiàn)化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）編碼的Cas9蛋白也能夠與細(xì)菌熟悉的入侵DNA結(jié)合，并將其降解。雖然我們知道切割位點(diǎn)只能由crRNA決定，但是科學(xué)家們卻驚奇地發(fā)現(xiàn)，Cas9蛋白與目標(biāo)DNA結(jié)合以及切割的過(guò)程還必須有tracrRNA分子的參與。也就是說(shuō)，tracrRNA分子能夠幫助Cas9-crRNA復(fù)合體在細(xì)胞復(fù)雜的DNA環(huán)境中精準(zhǔn)地定位到入侵的DNA序列上，如附圖所示。這也進(jìn)一步說(shuō)明小RNA分子的確是細(xì)胞里不可或缺的一份子。

瑞士軍刀樣的多功能蛋白。（A）Cas9蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同幫助才能識(shí)別入侵的外來(lái)DNA分子，與之結(jié)合并將其降解。因?yàn)閏rRNA中的向?qū)ф湶糠挚梢耘c外源DNA的一條鏈互補(bǔ)并結(jié)合形成R環(huán)結(jié)構(gòu)。在被識(shí)別區(qū)域兩端的DNA基序也起到了非常重要的作用，它們可以幫助DNA鏈結(jié)旋打開(kāi)雙鏈，有利于crRNA鏈侵入。然后靶標(biāo)DNA會(huì)在Cas9蛋白兩個(gè)核酶結(jié)構(gòu)域的作用下被切斷。（B）級(jí)聯(lián)反應(yīng)復(fù)合體里含有一個(gè)crRNA，可是卻最多攜帶了5種不同的Cas蛋白。所以它能夠持續(xù)不斷地招募核酶和解旋酶Cas3蛋白，不停歇地將入侵的外源DNA打開(kāi)并切斷。

 
Cas9蛋白能夠憑借分子內(nèi)的兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域切割靶標(biāo)DNA分子，形成平末端產(chǎn)物，其中每一個(gè)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割靶標(biāo)DNA分子R環(huán)狀（R-loop）結(jié)構(gòu)中的一條DNA鏈，具體來(lái)說(shuō)，就是一個(gè)HNH核酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的那一條DNA鏈，RuvC核酶結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條DNA鏈。Jinek等人發(fā)現(xiàn)這種切割的效率非常高，而且不論靶標(biāo)DNA分子是松弛型的，還是緊密的超螺旋型的都可以被毫不費(fèi)力地被切割開(kāi)，說(shuō)明Cas9蛋白在細(xì)胞里是循環(huán)使用的，這樣能保證在第一時(shí)間將所有來(lái)犯的入侵者全都消滅掉。

這種防衛(wèi)機(jī)制雖然很有效率，但它也存在致命的阿喀琉斯之踵。比如病毒就可以通過(guò)突變的方式輕易地突破這道防線。Jinek等人在對(duì)這種突變DNA分子進(jìn)行研究的時(shí)候發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白對(duì)突變DNA的結(jié)合能力和切割能力都會(huì)大打折扣，這說(shuō)明病毒完全能夠應(yīng)付細(xì)菌這套免疫機(jī)制，也說(shuō)明細(xì)菌需要重新修正記憶內(nèi)容才能夠面對(duì)新一輪攻擊。魔高一尺道高一丈，千百年來(lái)細(xì)菌與其寄生者之間就在不斷地重復(fù)這套攻守流程，最后大家共同進(jìn)化。

Jinek等人還敏銳地意識(shí)到這種高度特異性的由RNA介導(dǎo)的DNA核酶剛好可以被我們用來(lái)對(duì)基因組進(jìn)行特異性的改造。從理論上來(lái)說(shuō)，只需要一段20bp的crRNA做向?qū)?，核酶就可以在真核生物基因組的任意位置進(jìn)行特異性切割。為了驗(yàn)證這個(gè)想法Jinek等人使用一個(gè)攜帶了綠色熒光蛋白GFP編碼基因的質(zhì)粒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。他們根據(jù)某個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一套crRNA和tracrRNA，結(jié)果Cas9蛋白就在預(yù)定位點(diǎn)準(zhǔn)確地完成了切割任務(wù)。DNA斷裂之后還激活了細(xì)胞內(nèi)的DNA斷裂修復(fù)機(jī)制，科學(xué)家們利用這種反應(yīng)就可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因進(jìn)行破壞、插入或者修復(fù)等操作了。使用Cas9蛋白和crRNA在DNA上引入特異性斷裂這樣一套技術(shù)對(duì)我們現(xiàn)有的鋅指核酶技術(shù)（zinc finger nucleases）和轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子樣核酶技術(shù)（transcription activator–like effector nucleases）等基因靶向操作技術(shù)（gene-targeting technologies）是一個(gè)很好的補(bǔ)充和完善，因?yàn)檫@些現(xiàn)有技術(shù)都需要針對(duì)每一個(gè)靶點(diǎn)重新設(shè)計(jì)核酶。有了這種基因改造和修復(fù)技術(shù)我們就可以對(duì)患者的病變細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，然后再將修復(fù)好的細(xì)胞重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這樣就可以對(duì)多種遺傳缺陷疾病進(jìn)行很好的治療了。

和CRISPR系統(tǒng)里的其它效應(yīng)分子相比，Cas9蛋白明顯要重要得多，它是一個(gè)單一的、具有多種酶活性的蛋白，分子量通常介于350kD至450kD之間，最多的時(shí)候可以由11個(gè)亞基組成，編碼Cas9蛋白的基因也有4至7個(gè)之多?？墒沁@么龐大的一個(gè)蛋白卻只有在結(jié)合了靶標(biāo)DNA之后才會(huì)再招募其它亞基，使Cas9蛋白具有核酶活性。也就是說(shuō)，Cas9蛋白就好像一把瑞士軍刀一樣，有很多的組成部件，所以也有眾多的功能，CRISPR系統(tǒng)正因?yàn)橛辛诉@個(gè)多面手才能不懼任何外來(lái)的威脅。

原文檢索：
Stan J. J. Brouns. (2012) A Swiss Army Knife of Immunity. Science, 337:808-809.
YORK/編譯