蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。
蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法代來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：
物理性質(zhì)：紫外分光光度法
化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry 法，BCA法，膠體金法
染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法
其他性質(zhì)：熒光法
蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒?，以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。

常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較

由于凱氏定氮法的操作作過(guò)于復(fù)雜，雙縮脲法的靈敏度又太低，下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。

一、 Folin－酚試劑法（又名Lowry）法
目前實(shí)驗(yàn)室較多用用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有最大顯色，并最少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【原    理】
蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。
【操    作】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用生理鹽水補(bǔ)足到 1ml。加入5ml的堿性酮試劑，混勻后室溫放置20分鐘后，再加入0.5ml酚試劑混勻。

30分鐘后，以第1管為空白，在650nm波長(zhǎng)比色，讀出吸光度，以各客的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定。
稀釋血清（或其它蛋白樣品濃度）：準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理鹽水釋釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作：

混勻各管，30分鐘后，在波長(zhǎng)650nm比色，讀取吸光度。
【計(jì)    算】
1、以測(cè)定管讀數(shù)查找標(biāo)準(zhǔn)曲線求得血清蛋白含量。
2、無(wú)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可以與測(cè)定管同樣操作的標(biāo)準(zhǔn)管按下式計(jì)算蛋白含量：
血清蛋白含量（g%）＝

【試劑配制】
1、堿性酮溶液：
甲液：Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH 100ml溶液中。
乙液：CuSO4?5H2O 0.5克溶于1％酒石酸鉀100ml中。
取甲液50ml，乙液1ml混合。此液只能臨用前配制。
2、酚試劑：
取Na2WO4?2H2O 100g和Na2MoO3?2H2O 25g，溶于蒸餾水700ml中，再加85％H3PO4，50ml和HCl（濃）100ml，將上物混合后，置1500ml園底燒瓶中溫和地回流10小時(shí)再加硫酸鋰（Ll2SO2?H2O）150g，水50ml及溴水?dāng)?shù)滴，繼續(xù)沸騰15分鐘以除去剩余的溴，冷卻后稀釋至1000ml，然后過(guò)濾，溶液應(yīng)呈黃色（如帶綠色者不能用），置于棕色瓶中保存。使用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，以酚酞為指示液，而后稀釋約一倍，使最后濃度為lN。
3、蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（0.1mg/ml）
準(zhǔn)確稱取10mg牛血清蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度。溶后分裝，放于－20℃冰箱保存。
【注意事項(xiàng)】
1、Tris緩沖液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚類、檸檬酸以及高濃度的尿素、胍、硫酸鈉、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均會(huì)干擾Folin-酚反應(yīng)。
2、當(dāng)酚試劑加入后，應(yīng)迅速搖勻（加—管搖一管）以免出現(xiàn)渾濁。
3、由于這種呈色化合物組成尚未確立，它在可見光紅外光區(qū)呈現(xiàn)較寬吸收峰區(qū)。不同實(shí)驗(yàn)室選用不同波長(zhǎng)，有選用500或 540nm，有選用640nm，700或750nm。選用較高波長(zhǎng)，樣品呈現(xiàn)較大的光吸收，本實(shí)驗(yàn)選用波長(zhǎng)650nm。

二、考馬氏亮藍(lán)G－250染色法
此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多。
【原    理】
考馬氏亮藍(lán)G－250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。
【操作步驟】
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：
按下表操作，在試管中分別加入0、20、40、80、100微克蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水補(bǔ)足到100微升，加入3ml的染色液，混勻后室溫放置15分鐘。

在595nm波長(zhǎng)比色，讀出吸光度，以各管的標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以其吸光度為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、血清蛋白質(zhì)測(cè)定
稀釋血清（或其它蛋白樣品溶液），準(zhǔn)確吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度（此為稀釋500倍，其它蛋白樣品酌情而定）。再取三只試管，分別標(biāo)以1、2、3號(hào)，按下表操作?；靹蚝笫覝胤胖?5分鐘，在595nm波長(zhǎng)比色，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
 

 【計(jì)    算】
每100毫升血清中蛋白質(zhì)的含量（g％）＝

【試    劑】
1、考馬氏亮藍(lán)G－250染色液：
稱取100mg考馬氏亮藍(lán)G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀釋到1升。
2、蛋白標(biāo)準(zhǔn)（0.1mg/ml）
準(zhǔn)確稱取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理鹽水至刻度，溶后分裝，－20℃冰箱保存。
【注意事項(xiàng)】
1、常用試劑的干擾：有些常用試劑在測(cè)定中會(huì)受到不同程度的干擾。Tris、巰基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢劑有較少影響，而1％SDS、1％ TritonX-100及1％Hemosol的干擾嚴(yán)重。
2、顯色結(jié)果受時(shí)間與溫度影響較大，須注意保證樣品與標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定控制在同一條件下進(jìn)行。
3、考馬氏亮藍(lán)G－250染色能力很強(qiáng)，特別要注意比色杯的清洗。顏色的吸附對(duì)本次測(cè)定影響很大?？蓪y(cè)量杯在0.1mol/L HCl中浸泡數(shù)小時(shí)，再?zèng)_洗干凈即可。

三、紫外分光光度法
紫外光譜吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是將蛋白質(zhì)溶液直接在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定的方法，不需要任何試劑，操作很簡(jiǎn)便，而且樣品可以回收。
【原    理】
蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強(qiáng)烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過(guò)程中雜有的核酸對(duì)測(cè)定結(jié)果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時(shí)測(cè)定280及260nm兩種波長(zhǎng)的吸光度，通過(guò)計(jì)算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量。
【操    作】
將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液適當(dāng)稀釋K倍，在紫外分光度計(jì)中分別測(cè)定樣品在10mm光徑石英比色皿中，分別在280nm及260nm兩種波長(zhǎng)下的吸光度值A(chǔ)280和A260。
【計(jì)    算】
1、當(dāng)?shù)鞍讟悠返奈馐毡戎礎(chǔ)280／A260約為1.8，可用下面的公試進(jìn)行計(jì)算：
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）＝（1.45A280 －0.74A260）×K
2、也可以先計(jì)算出A280／A260的比值后從下表中查出校正因子 “F”值，由下面的經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算出溶液的蛋白質(zhì)濃度。同時(shí)從表中還可以查出樣品中混雜的核酸的百分含量：
蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）＝F×A280 ×K

注：一般純凈蛋白質(zhì)的光吸收比值A(chǔ)280/A260約為1.8，而核酸A280/A260的比值約為0.5。
【方法評(píng)價(jià)】
操作簡(jiǎn)便、樣品溶液可回收，同時(shí)可估計(jì)核酸含量。但核酸含量小于20％或溶液混濁、則測(cè)定結(jié)果誤差較大。在使用上表和公式計(jì)算時(shí)也應(yīng)注意各種蛋白質(zhì)和各種核酸在 280nm及260nm處的光吸收值也不盡相同，故計(jì)算結(jié)果有一定誤差。

四、雙縮脲法
【原    理】
利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來(lái)，而此時(shí)血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài)，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學(xué)，而且還廣泛地用于生物化學(xué)研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)—酶、蛋白激素等的分離和純化。
蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。
但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物
以及分子內(nèi)有—CH2—NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽(yáng)性。本實(shí)驗(yàn)用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用濾紙過(guò)濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應(yīng)測(cè)定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。
【操    作】
1、取中試管4支，分別標(biāo)以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉1ml，置“1”管中備用。
2、吸取血清0.2ml于另一試管中，加27.8％硫酸鈉一亞硫酸鈉4.8ml，用拇指壓住管口倒轉(zhuǎn)混合5～6次，放置約15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管 “4”中（總蛋白測(cè)定管）。
3、將剩余的血清混懸液（如濾液不清，可重復(fù)過(guò)濾，直至澄清為止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管 “3”（白蛋白測(cè)定管）。
4、另用一支1ml刻度吸管吸取標(biāo)準(zhǔn)血清1ml，置管“2”中（標(biāo)準(zhǔn)管）。
5、于上述4支試管中分別加入雙縮脲試劑4ml，混勻。
6、在室溫下放置10分鐘后，以管“1”（空白管）調(diào)零，在540nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，分別記錄“2”、“3”、“4”管的光密讀數(shù)
【計(jì)    算】

血清球蛋白含量（克／100ml）＝總蛋白含量—白蛋白含量
白：球比值＝白蛋白含量／球蛋白含量。
【臨床意義】
正常人每100ml血清中含蛋白質(zhì)6～8克，平均7克左右，白／球比為1.5～2.5:1。長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)不良，肝臟疾病，慢性腎炎時(shí)，總蛋白含量降低；大量失水（如嘔吐、腹瀉）時(shí)則升高。肝臟疾病、慢性腎炎以及慢性傳染病有大量抗體生成時(shí)，白／球比值變小，甚至倒置。
【試劑與器材】
（一）器材
1、中試管 6支。
2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。
3、玻璃漏斗。
4、快速濾紙。
5、分光光度計(jì)。
（二）試劑
1、27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液：取濃硫酸2ml加到900ml蒸餾水中，將此含酸蒸餾水加于盛有無(wú)水硫酸鈉208克及無(wú)水亞硫酸鈉 70克，的燒杯中，邊加邊攪拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度。取此溶液1ml，加蒸餾水24ml，檢查其pH，應(yīng)為7或略高于 7，本試劑應(yīng)貯于25℃溫箱中。
2、雙縮脲試劑：稱取硫酸銅（CuSO4·5H2O）1.5克及石酒石酸鉀鈉（C4H4O6KNa·4H2O）6克，分別用適量蒸餾水溶解，混合后加入10％NaOH溶液300ml，最后加蒸餾水至1000ml。
3、標(biāo)準(zhǔn)血清：取經(jīng)凱氏定氮標(biāo)定后的血清用15％的 NaCl溶液稀釋25倍，貯于冰箱中備用。
【注意事項(xiàng)】
（一）硫酸鈉的溶解度與溫度有關(guān)，溫度低于30℃易結(jié)晶析出，故室溫較低時(shí)應(yīng)在37℃水浴或恒溫箱進(jìn)行保溫。
（二）血清樣品必須新鮮，如有細(xì)菌污染或溶血，則不能得到正確的結(jié)果。
（三）含脂類較多的血清，可用乙醚3ml抽提一次后再進(jìn)行測(cè)定。