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蛋白質(zhì)濃度測(cè)定是利用化學(xué)或物理方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，一般蛋白濃度測(cè)定的方法有很多種，每種方法都有優(yōu)點(diǎn)和局限性，下面我們就具體看一下蛋白濃度測(cè)定的方法都有哪些。 蛋白濃度測(cè)定的方法： 1. 紫外分光光度法 紫外光譜吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是講蛋白質(zhì)溶液直接在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定的方法，不需要任何試劑，操作簡(jiǎn)單且易回收。蛋白質(zhì)溶液在280nm附近有強(qiáng)烈的吸收，這是由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對(duì)測(cè)定結(jié)果引起極大誤差，其大吸收在260nm。所以同時(shí)測(cè)定280及260nm兩種波長(zhǎng)的吸光度，通過計(jì)算可得較為正確的蛋白質(zhì)含量。 2. 雙縮脲法 利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來，而此時(shí)血清白蛋白仍處于溶解狀態(tài)，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質(zhì)的方法不僅用于臨床醫(yī)學(xué)，而且還廣泛地用于生物化學(xué)研究工作中，如一些特殊蛋白質(zhì)—酶、蛋白激素等的分離和純化。 蛋白質(zhì)和雙縮脲一樣，在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡(luò)合物（雙縮脲反應(yīng)），且其呈色深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，因此可于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。 但必須注意，此反應(yīng)并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有—CH2—NH2等結(jié)構(gòu)化合物，雙縮脲反應(yīng)也呈陽性。本實(shí)驗(yàn)用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，剩余部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應(yīng)測(cè)定白蛋白的含量?？偟鞍着c白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。 3. Folin-酚試劑法 目前實(shí)驗(yàn)室較多用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，此法的特點(diǎn)是靈敏度高，較雙縮脲高兩個(gè)數(shù)量級(jí)，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應(yīng)約在15分鐘有大顯色，并少可穩(wěn)定幾個(gè)小時(shí)，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質(zhì)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。其原理是蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。 4. 考馬氏亮藍(lán)G-250 此方法是1976年Bradform建立。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高，可檢測(cè)到微量蛋白，操作簡(jiǎn)便、快迅，試劑配制極簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，但干擾因素多?？捡R氏亮藍(lán)G－250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當(dāng)它通過疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后，變成藍(lán)色，大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處，在一定的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與 595nm的吸光度成正比，測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。 以上便是實(shí)驗(yàn)室中常見的幾種蛋白濃度測(cè)定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結(jié)果，但操作復(fù)雜，BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎。 5、BCA法測(cè)蛋白含量 原理：二價(jià)銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價(jià)銅離子，一價(jià)銅離子和獨(dú)特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。 試劑： (1) BCA試劑的配制 ① 試劑A，1L：分別稱取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O(2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3(0.95%) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。 ②試劑B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。 ③BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。 (2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取0.5g牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成5mg/ml的溶液。用時(shí)稀釋十倍。 試驗(yàn)操作 a、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 取96孔酶標(biāo)板，按下表加入試劑。
上述試劑加完后，準(zhǔn)確吸取20μl樣品溶液于酶標(biāo)孔中，加入BCA試劑200μl，輕搖，于37℃保溫30-60min，冷卻至室溫后，以空白為對(duì)照，在酶標(biāo)儀上562nm處比色，以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 b、稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，使樣品稀釋液總體積為20ul，加入BCA工作液200ul，充分混勻，37℃保溫30-60min，以標(biāo)準(zhǔn)曲線空白為對(duì)照，根據(jù)樣品的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。 c、根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可差得相應(yīng)的蛋白含量，除以樣品稀釋液總體積（20ul),乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度（單位：ug/ul）。 |
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