甲基化特異性PCR(MSP)
甲基化特異性新型PCR(MSP)甲基化特異性PCR(MSP) |
1)MSP原理：MSP是一種簡(jiǎn)便、特異的、敏感的檢測(cè)單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對(duì)特異性的引物對(duì)所測(cè)基因的同一核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。 |  |
MSP示意圖 | 注：①亞硫酸氫鈉處理；QPCR | 此原理的關(guān)鍵在于3對(duì)特異引物的設(shè)計(jì)。引物序列設(shè)計(jì)在富含胞嘧啶區(qū)域以區(qū)別亞硫酸氫鈉處理后轉(zhuǎn)化的非甲基化的DNA與未轉(zhuǎn)化的甲基化的DNA，在引物的3’端，至少含有3個(gè)CpG位點(diǎn)，以保證區(qū)別甲基化與非甲基化DNA。野生型引物對(duì)直接根據(jù)基因組的待測(cè)序列設(shè)計(jì)。甲基化引物對(duì)與非甲基化引物對(duì)分別根據(jù)待測(cè)序列的CpG位點(diǎn)甲基化與非甲基化時(shí)，經(jīng)亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化后的序列設(shè)計(jì)。野生型引物只能擴(kuò)增出未經(jīng)亞硫酸氫鈉處理的基因片段，甲基化引物對(duì)與非甲基化引物對(duì)只能分別擴(kuò)增甲基化與非甲基化的基因片段，由此達(dá)到檢測(cè)基因甲基化的目的。 | 2)亞硫酸氫鈉處理DNA的具體方法 | (1)在50ul體系中，DNA(2—5ug)經(jīng)NaOH(終濃度值0．2 mol／L)在37℃變性10Min。對(duì)于ng級(jí)別的人基因組DNA，在進(jìn)行修飾前加入2／／g蛙魚(yú)精DNA為載體。 | (2)加入30u1剛配制好的10mmo]／L氫醌與520／／1的40．5％亞硫酸氫鈉混勻，之后石蠟油隔絕空氣的條件下，避光在50％溫育16h。 | (3)修飾后的DNA過(guò)WizerdDNA純化柱，用50／1l水洗脫。室溫下用NaOH(終濃度為0．3mol／L)修飾5min，之后用乙醇沉淀。 | (4)DNA溶于20u1水中，立即使用或在20~C保存。 | 3)MSP優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：與其他方法相比，MSP從非甲基化模板背景中檢測(cè)甲基化模板的敏感性大大提高，是最敏感的甲基化測(cè)定方法。其缺點(diǎn)是需要兩組已知的關(guān)鍵性CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)上下游引物，并且這些位點(diǎn)必須完全甲基化或完全不甲基化。事實(shí)上，能夠完全滿足這些條件的基因數(shù)目不多，該方法具有明顯的基因“選擇性”。在很多情況下，為了擴(kuò)增到PCR產(chǎn)物，不得不降低退火溫度，其后果是形成許多非特異性產(chǎn)物。隨著退火溫度的降低，該方法可靠性也隨之下降。 |
|
|
來(lái)自： 建村 > 《我的圖書(shū)館》
