干貨︱特異性位點甲基化檢測技術(shù)的比較和選擇

生物_醫(yī)藥_科研 2019-08-08

展開全文

通常全基因組甲基化分析作為一種高通量的篩選發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的手段，常見的技術(shù)包括850K芯片，安捷倫捕獲測序，MeDIP-seq，RRBS，WGBS等。特異位點甲基化檢測一般在作為一種后期的技術(shù)驗證手段，常見的技術(shù)包括：MSP、BSP、焦磷酸測序以及質(zhì)譜檢測。特異性位點的甲基化驗證技術(shù)各有不同，我們又該如何選擇呢？今天小編將為大家介紹MSP、BSP、焦磷酸測序以及質(zhì)譜甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點，以便于大家根據(jù)自己的實驗需求選擇合適的驗證技術(shù)。

Prosequencing(焦磷酸測序)

焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）：是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。焦磷酸測序法適于對已知的短序列（<50bp）的測序分析，主要包括甲基化位點和單核苷酸多態(tài)性的定量檢測。隨著技術(shù)的不斷改進，現(xiàn)在認為焦磷酸測序技術(shù)（Pyrosequencing）是甲基化檢測新的金標(biāo)準(zhǔn)。序列延伸過程中，根據(jù)C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T 比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測，并給出精確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN公司在焦磷酸測序的應(yīng)用上具有明顯的優(yōu)勢，目前提供三種焦磷酸測序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMark Q24 的強項在于可對多達24個樣品進行焦磷酸測序。需要大樣品量的應(yīng)用更適合在PyroMark Q96 ID 上進行。在考慮到處理成百上千個樣品所需的大量試劑時，運行通量最大化可能會使實驗成本變得很高。而PyroMark Q96 MD裝有一臺高度靈敏的光檢測攝像頭，可以在減少試劑量的情況下對少量的DNA模板進行準(zhǔn)確測序。這些不同平臺的推出，對于我們實際研究提供了更有效的檢測手段。

雖然焦磷酸測序可以進行單個位點甲基化程度的精確定量，但是目前來看，測序的片段長度還比較短，有效長度約為60bp。

橫坐標(biāo)：依次加入的dNTP；

縱坐標(biāo)：相對熒光強度；

百分比：目的位點的甲基化頻率；

每個峰的高度代表該種dNTP的摻入情況，峰高與摻入的核苷酸數(shù)量成正比；

黃色柱狀：判定亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化是否完全。

MSP

Herman等1996年在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。它將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。MS-PCR中設(shè)計兩對引物，并要求：1.引物末端均設(shè)計至檢測位點結(jié)束;2.兩對引物分別只能與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結(jié)合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結(jié)合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MSP擴增產(chǎn)物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化;若用針對處理后的非甲基化DNA鏈的引物擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化。DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，以處理后的產(chǎn)物作為模板，加入甲基化特異性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)，進行特異性的擴增，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產(chǎn)物。

BSP

直接測序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法過程是：重亞硫酸鹽使DNA中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后,對PCR產(chǎn)物進行測序并且與未經(jīng)處理的序列比較,判斷是否CpG位點發(fā)生甲基化。

這種方法一度被認為是DNA甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它的過程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計引物進行PCR擴增目的片段，并對PCR產(chǎn)物進行克隆測序，將序列與未經(jīng)處理的序列進行比較，判斷CpG位點是否發(fā)生甲基化。

質(zhì)譜（MALDI-TOF MS技術(shù)）

堿基特異性酶切（MassCLEAVE）實驗首先需用亞硫酸鹽處理 DNA，經(jīng)過處理后 DNA 中的未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶則保持不變。然后利用 5' 末端帶有 T7- 啟動子的引物進行 PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng) SAP( 蝦堿性磷酸酶 ) 處理后再進行堿基特異性的酶切反應(yīng)。酶切后基因組 DNA 片段的大小和分子量取決于亞硫酸鹽處理后的堿基變化，結(jié)果使含與不含 CpG 位點的片段的質(zhì)量相差 16Da，飛行質(zhì)譜儀器則能測出每個片段的分子量，EpiTYPER 則能自動報每個相應(yīng)片段的具體甲基化數(shù)。