在分子克隆的所有操作中，最基本的操作也許要算核酸的純化了。其關(guān)鍵步驟是去除蛋白質(zhì)，通常只要用酚：氯仿抽提核酸的水溶液即可。每當(dāng)在進(jìn)行下一步操作之前需要把這一步克隆操作所用的酶滅活并去除時，都可采用這種抽提的方法。然而如果要從各種復(fù)雜分子的混合物如細(xì)胞裂解液中純化核酸，則需一些附加辦法。在這些情況下，通常是在有機(jī)溶劑抽提之前先用某些蛋白水解酶去掉大部分蛋白質(zhì)，這些廣譜的蛋白水解酶包括鏈霉蛋白酶及蛋白酶K .

用酚：氯仿抽提

從核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法是先用酚：氯仿(可含有0.1%的8-羥基喹啉)抽提后再用氯仿抽提。這個方法的好處是使用兩種不同有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)比用單一有機(jī)溶劑效果更佳。此外，酚雖能有效地使蛋白質(zhì)變性，卻不能完全抑制RNA酶的活性，酚還能溶解帶有長poly(A)的RNA分子(Brawerman et al.1972)。用酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)混合液抽提能夠使這兩個問題同時得以解決。隨后用氯仿抽提則可去除殘留在核酸制品中痕量的酚。通過乙醚抽提去除酚已廣泛沿用多年，看來在目前的常規(guī)操作中已不必要或者不推薦使用。

(1)將樣品轉(zhuǎn)移到一只聚丙烯離心管中，加入等體積的酚：氯仿。

如果酚未被充分平衡至pH值為7.8-8.0，核酸將趨于分配到有機(jī)相。

(2)混合管中的內(nèi)容物使之成為乳濁液。

(3)室溫下用離心管可承受最大轉(zhuǎn)速的80%的速度離心1min，若有機(jī)相與和水相不能充分分開，延長時間重新離心。

一般情況下水相處于上層，然而當(dāng)水相中鹽濃度(>0.5mol/L)或蔗糖濃度(>10%)過高而密度較大時，水相可能會在下層。由于在平衡酚時加了8-羥基喹啉(見附錄1)，其黃顏色可使有機(jī)相易于辨別。

(4)用移液管把水相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，體積較小(<200ul)時可用帶一次性吸頭的自動移液器操作。棄去兩相間的界面層和有機(jī)相。

為了獲得最高的收率，可按下法對有機(jī)相和介面層進(jìn)行“回提”：按上述方法第一次移出水相后，在剩余的有機(jī)相和介面層中加入等體積TE(PH7.8)，充分混勻，按第3步離心分離兩相，合并兩次得到的水相，繼續(xù)按第5步操作。

(5)重復(fù)1～4步，直55有機(jī)相和水相之間的界面上看不到蛋白質(zhì)。

(6)加入等體積的氯仿并重復(fù)2～4步。

(7)用乙醇沉淀的標(biāo)準(zhǔn)方法回收核酸。

偶爾也使用乙醚

[注]有機(jī)相與水相的混合，在分離小分子DNA(<10kb)時可使用旋渦混合器，分離中等大小DNA分子(10--30kb)時可輕輕搖動，而當(dāng)分離大分子(>30kb)時則須注意以下事項(xiàng)，以避免對DNA的剪切作用 .轉(zhuǎn)鼓上緩慢轉(zhuǎn)動(20r/mm)離心管，使有機(jī)相與水相混勻。

ii將DNA從一管轉(zhuǎn)移到另一管時應(yīng)使用大口徑吸管。

關(guān)于酚(C6H6O，F(xiàn).W.=94.11)抽提的歷史小記

直到20世紀(jì)50年代，純化DNA的標(biāo)準(zhǔn)操作方法還是用去污劑和強(qiáng)鹽(如高氯酸鹽)溶液從蛋白質(zhì)上脫下核酸，最終去除蛋白是用含有異戊醇的氯仿多次抽提實(shí)現(xiàn)的(Sevag 1934，Sevag et al.1938)。利用酚純化核酸是Kirty首次報道的(1956)，這時他得知酚具有從水相中抽提蛋白的能力(Grassmann and Definer 1953)。在Kirty最初的論文中，是用酚—水兩相混合液在室溫下提取哺乳動物勻漿，結(jié)果RNA分配到了水相，而DNA結(jié)合在蛋白上留在兩相界面上。Kirty很快意識到用陰離子鹽的溶液代替水就能將RNA和DNA同時釋放到水相(Kirty 1957，綜述見Kirty 1964)。用陰離子鹽從DNA中釋放蛋白質(zhì)的方法很快被廢棄，而代之以SDS等強(qiáng)陰離子去污劑。盡管如此，Kirty最初描述的酚抽提法奠定了今天常用的許多純化方法的基礎(chǔ)。酚的作用可能與蛋白質(zhì)溶劑相同，可以把陰離子鹽或去污劑從核酸上解離下來的蛋白質(zhì)抽提出來。這個過程如此高效，以至于僅僅經(jīng)過兩三次酚抽提就能得到純的核酸制品。

純酚的比重為1.07，因此在與水混合時應(yīng)處于下層。然而有機(jī)相和水相會難于分開，甚至當(dāng)從溶質(zhì)濃度較高的水相中抽提蛋白時會發(fā)生兩相顛倒的情況。若使用50:50的酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重較大(1.47)，可在很大程度上解決這個問題，促進(jìn)兩相的分離。變性蛋白一般集中在兩相之間的界面層，而脂類則有效地分配在有機(jī)相中。一般在酚：氯仿混合物中加一些異戊醇以減少泡沫的產(chǎn)生。

純的酚為白色結(jié)晶狀(mp為43℃)，但酚暴露在空氣和光線下會趨于變紅，堿性條件能夠加速這種變化。不主張使用結(jié)晶酚，因?yàn)榻Y(jié)晶酚必須在182℃下重蒸去除諸如醌類等氧化產(chǎn)物，這些物質(zhì)能夠引起磷酸二酯鍵斷裂或促進(jìn)核酸交聯(lián)。

許多供應(yīng)商提供的液態(tài)酚含有大約8%的水，可于-20℃冷凍保藏。液化酚若為無色可不經(jīng)蒸餾用于分子克隆。現(xiàn)在只有偶爾批次的液態(tài)酚會呈粉色或黃色，可拒收這些產(chǎn)品，退回廠家。

酚在使用前必須用水飽和并用Tris平衡至pH>7.8，以防DNA分配到有機(jī)相，這種情況在酸性pH下會

發(fā)生。

點(diǎn)滴透析

低分子質(zhì)量雜質(zhì)能抑制限制酶的消化作用或妨礙DNA測序，可通過點(diǎn)滴透析從溶液中除去這些雜質(zhì)。

(1)在Millipore SeriesV膜(0.025 pm)上涂一滴(約50ul)DNA，在10cm直徑的 Petri培養(yǎng)皿中內(nèi)盛10ml無菌水，將膜的光亮面朝上漂浮在水上。

(2)使DNA透析10min。

(3)將液滴轉(zhuǎn)移到一只干凈的微型離心管中，從透析的DNA中取一小份進(jìn)行限制酶消化及DNA測序。

核酸的濃縮

注意：在注有{!)處材料的正確使用參見附錄12。

乙醇沉淀

乙醇沉淀是從水溶液中回收核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法具有快速、簡便、高效的優(yōu)點(diǎn)，亞毫微克量的DNA和RNA可由乙醇定量地沉淀下來。然后可通過離心收集，并在數(shù)分鐘內(nèi)重新溶解。

乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來。Na+之類的平衡離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時才會發(fā)生乙醇沉淀。最常用的陽離子，見表A8-1及以下的敘述。

表A8-1 鹽溶液

(1)醋酸銨常用于減少多余的雜質(zhì)(如dNTP及多糖)與核酸的共沉淀。例如在2mol/L醋酸銨存在下連續(xù)兩次DNA沉淀可從DNA制品中除去>99%的dNTP(Okayama and Berg 1982)。在通過瓊脂糖酶消化瓊脂糖之后沉淀核酸時，使用醋酸銨也是最佳選擇，這種陽離子可減少寡糖消化產(chǎn)物共沉淀的可能性。然而若用沉淀的核酸進(jìn)行磷酸化時，就不要用醋酸銨沉淀核酸，因?yàn)殇@離子能抑制T4噬菌體多核苷酸激酶。

(2)氯化鋰常用于需高濃度乙醇進(jìn)行的沉淀(如沉淀RNA)。LiCl在乙醇溶液中的溶解度很高而且不隨核酸共沉淀。小分子RNA(如tRNA及5SRNA)在高離子強(qiáng)度下(沒有乙醇時)是可溶的，而大分子RNA則不溶?？梢岳眠@個差異在高濃度LiCl(0.8mol/L)中純化大分子RNA。

(3)氯化鈉 (0.2mol/L)用于DNA樣品中存在SDS時。這種去污劑在70%乙醇中仍為可溶。

(4)醋酸鈉 (0.3mol/L，pH 5.2)在DNA和RNA的常規(guī)沉淀中最為常用。

直到幾年前，常規(guī)的乙醇沉淀還是在低溫下(如在干冰—甲醇浴中)進(jìn)行，現(xiàn)在知道這并無必要。在0℃且沒有載體存在的情況下，即使?jié)舛鹊椭?0ng/ml的DNA也能形成沉淀，并可在微型離心管中通過離心定量地加以回收。然而在沉淀低濃度的DNA或很小的片段(長度<100核苷酸)時，則需延長離心時間，使核酸沉淀更緊密地附著在離心管上。在沒有載體存在的情況下，于100000g離心20～30min可回收到皮克級的核酸。

在處理少量DNA時，一種謹(jǐn)慎的做法是留下是每一步操作中含乙醇的上清液，直到把所有DNA回收回來。在用70%乙醇洗滌DNA沉淀時這種留樣的做法尤為重要，因?yàn)橄礈爝^程往往使沉淀在管壁上的DNA變松散。

DNA沉淀的溶解

直到幾年之前，回收的DNA沉淀在溶解以前還是經(jīng)過真空干燥。這種做法現(xiàn)已廢棄，這是因?yàn)椋孩俑稍锏腄NA沉淀溶解緩慢且效率較低；②雙鏈小分子DNA(<400bp)在干燥時會變性，原因可能是在干燥過程中失去了起到穩(wěn)定作用的結(jié)合水分子外層(Svaren et al.1987)。

目前最好的辦法是通過輕輕吸氣移出DNA沉淀和離心管邊緣上的乙醇，在實(shí)驗(yàn)臺上敞口放置約15min揮去殘余的乙醇，當(dāng)DNA沉淀仍有些潮濕的時候用適當(dāng)緩沖液溶解便可溶得快速而且完全。必要時可將重溶了DNA的離心管敞口放在45C加熱塊上保溫2～3min揮盡殘留的乙醇。

固定角度轉(zhuǎn)頭離心所得的DNA沉淀不一定都在離心管的底部。例如，在使用微型離心管的情況下，至少40%的DNA沉淀是貼在管壁上。為了提高DNA的回收率，可用吸槍頭帶動溶劑的液滴在管壁適當(dāng)部位來回滾動數(shù)次。如果DNA樣品具有放射性，可在移出溶解的DNA之后加以檢測確定檢不出殘留的放射性。

載體

載體(或共沉淀劑)是在乙醇沉淀中用來提高少量核酸回收率的一種惰性物質(zhì)。載體不溶于乙醇，形成的沉淀能夠捕獲目標(biāo)核酸。離心時，載體能夠產(chǎn)生可見的沉淀，有助于對目標(biāo)核酸的操作。這大概是載體的主要優(yōu)點(diǎn)。如上所述，乙醇沉淀效率極高，即使對于稀溶液中的少量核酸仍是如此，載體除了為目標(biāo)核酸提供可見的線索之外并起不到多少實(shí)際作用。常用的載體有三種：酵母tRNA、糖原及線狀聚丙烯酰胺。它們各自的優(yōu)缺點(diǎn)列于表A8-2。

表A8-2 載體

歷史小記

乙醇沉淀的方法比分子克隆的出現(xiàn)要早大約50年，這種方法最早是J.Lionel AUoway用來濃縮生物活性核酸。Alloway于20世紀(jì)30年代早期在洛克菲勒學(xué)院工作，他計劃由S型肺炎鏈球菌制備能夠在體外轉(zhuǎn)化R型菌株的無細(xì)胞提取物。那時轉(zhuǎn)化還只是通過加熱滅活的完整細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)過多次挫敗之后，他在1932年報道能夠把起轉(zhuǎn)化作用的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到溶液中，其做法是將凍融的s型菌株提取物加熱到60℃，通過離心去除顆粒物，再將溶液通過多孔陶瓷濾器過濾(Alloway 1932)。上述最后一步操作的目的是為了消除這樣一個疑慮，即轉(zhuǎn)化是由提取過程中偶爾存活的s型菌株所造成的假象。

Alloway不用加熱致死的供體細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)化，這一成功在走向最終發(fā)現(xiàn)DNA是轉(zhuǎn)化物質(zhì)的道路上邁出了一大步(Avery 1944)。然而并不是Alloway制備的所有無細(xì)胞提取液均有轉(zhuǎn)化作用，即使有轉(zhuǎn)化作用的制備物轉(zhuǎn)化效率也很低?？赡蹵lloway意識到這個問題由于提取物的濃度太稀的緣故，他開始尋找各種裂解肺炎球菌的途徑以及濃縮轉(zhuǎn)化活性物質(zhì)的方法(Alloway 1933)。MaClyn McCarty(1985)這樣描述了Alloway發(fā)現(xiàn)乙醇沉淀方法的過程：

這時Alloway采用了一種新的方法，這個方法從此成為所有有關(guān)轉(zhuǎn)化物質(zhì)研究工作中不可缺少的操作方法。他加入5倍于提取物體積的純乙醇時，結(jié)果從肺炎球菌釋放出來的大部分物質(zhì)都沉淀下來……。沉淀物能重新溶于鹽溶液，并通過轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中含有轉(zhuǎn)化活性物質(zhì)，乙醇沉淀和重新溶解可以任意重復(fù)而未引起活性喪失。

當(dāng)然Alloway并非用乙醇沉淀核酸的第一人，這個方法已被幾代為DNA堿基結(jié)構(gòu)所困惑的有機(jī)化學(xué)家們在純化步驟中采用。Alloway卻是用乙醇沉淀制備能夠改變受體表型物質(zhì)的第一位科學(xué)家。最終證實(shí)轉(zhuǎn)化因子是DNA還延遲了十多年時間，但應(yīng)該公正地承認(rèn)Alloway是今天我們已經(jīng)習(xí)以為然的一項(xiàng)操作技術(shù)的發(fā)明者。

在微型離心管中乙醇沉淀的標(biāo)準(zhǔn)方法

(1)估計DNA溶液的體積。

(2)調(diào)整單價陽離子的濃度。若DNA溶液中含有高濃度的鹽，可用TE(pH8.0)稀釋，否則加入表A8-1列出的一種鹽。

如果DNA溶液的體積不超過400ul可在單個微型離心管中進(jìn)行沉淀，體積較大時可分成數(shù)管，或者在適宜于中速離心或超離心的離心管中進(jìn)行離心。

(3)充分混勻溶液，準(zhǔn)確加入2倍體積的冰冷乙醇，再充分混勻溶液。將此含乙醇的溶液置冰上使DNA沉淀形成。

一般放置15-30min就足夠了。但如果DNA分子太小(小于100個核苷酸)或者DNA的含量太低(低于0.1ug/ml)則需把在冰上放置的時間延長到1h以上并加入MgCl2至終濃度0.01mol/L。DNA可在含乙醇的溶液中于0℃或-20℃無限期地保存。

(4)于0℃離心回收DNA。

在多數(shù)情況下于最大轉(zhuǎn)速離心10min就足夠了。然而如以上所述，在沉淀低濃度DNA(低于20ng/ml)或非常小的片段時則需要延長離心的時間。

手持打開蓋子的微型離心管成一定角度，使沉淀物在上側(cè)，將一個一次性吸頭連至真空管道，從管內(nèi)抽吸液體。把吸頭置于離心管下側(cè)，恰好在液體的凹面以下。隨著液體的吸出，可將吸頭移向管底。抽吸要溫和，以免沉淀吸入吸頭，并應(yīng)使吸頭的尖部離開沉淀。最后吸盡附著于管壁的液滴。

(5)用自動微量移液器或連于真空管道的一次性吸頭(見圖A8-2)小心移出上清液，注意不要擾動沉淀(有時沉淀是看不見的)。用吸頭吸盡附于管壁的所有液滴。在沉淀比較珍貴的DNA樣品時，最好暫時留存上清液，直至確定已回收到沉淀的DNA后再廢棄。

(6)加半管70%乙醇，于4℃以最高轉(zhuǎn)速離心2min。

(7)重復(fù)第5步。

(8)將離心管于室溫下敞口放置在實(shí)驗(yàn)臺上，直至殘留的液體揮干。過去常用凍干機(jī)干燥沉淀，這一步不僅沒有必要，而且也不適當(dāng)，因?yàn)檫@樣會引起小片段DNA(小于 400個核苷酸)的變性(Svaren et al，1987)，還大大降低大片段DNA的收率。

(9)將DNA沉淀(沉淀常常是看不見的)重新溶解于適當(dāng)體積的緩沖液(一般為pH 7.6-8.0的TE)，用緩沖液充分漂洗管壁。

[注]i在微型離心管中離心之后，并非所有DNA沉淀都沉積在管底，沉積在管壁的DNA最多可達(dá)50%。為了回收到所有DNA，應(yīng)使液滴在管壁的適當(dāng)部位來回滾動，可用微量加液器上的一次性吸頭推動液滴。

ii可用1倍體積的異丙醇

iii一般用乙醇從溶液中沉淀出來的DNA重溶于低離子強(qiáng)度的緩沖液如TE(pH8.0)中比較容易，偶爾在用含MgCl2或濃度高于0.1mol/L Nacl的緩沖液直接溶解DNA沉淀時可能要遇到一點(diǎn)困難。因此最好是先用少量低離子強(qiáng)度的緩沖液將DNA溶解后再調(diào)節(jié)緩沖液的成分。若樣品不易溶于較小體積的緩沖液，可用多一些緩沖液溶解，再重新用乙醇沉淀。第二次沉淀有助于去除多余的鹽及可能妨礙DNA溶解的其他成分。

用乙醇沉淀RNA

RNA可以用含2.5-3.0倍體積的乙醇從含有0.8mol/L LiCl、5mol/L醋酸銨或0.3mol/L醋酸鈉的溶液中有效地沉淀下來。選擇上述哪一種鹽要取決于其后RNA的用途。由于十二烷基硫酸鉀鹽的極難溶，若要將沉淀得到的RNA溶于含SDS的緩沖液(如用寡聚dT-纖維素層析時就使用這種緩沖液)則應(yīng)避免使用醋酸鉀。同樣，如果RNA已溶于含有SDS的緩沖液中，沉淀時也不要用醋酸鉀。

[注]用于沉淀RNA的溶液應(yīng)是無RNA酶的(見第7章)。

用氯化鋰沉淀大分子RNA

小分子RNA(如tRNA和5SrRNA)在離子強(qiáng)度高的溶液中可溶，而大分子RNA(如rRNA和mRNA)則不溶，可通過離心沉淀下來。

(1)測量樣品的體積，加0.2倍體積無RNA酶的8mol/L LiCl，充分混勻，置冰浴中至少2h。

(2)于0℃以15000g離心20min，棄上清，將沉淀下來的大分子RNA重溶于0.2倍體積水中。

(3)重復(fù)1和2步。

(4)用2倍體積乙醇沉淀，從重懸的沉淀物中回收大分子RNA。

用微量濃縮器進(jìn)行核酸的濃縮及脫鹽

除乙醇沉淀外，超濾也是核酸溶液濃縮和脫鹽的一種可供選擇的方法。這種方法不需要相的變化，在處理低濃度核酸時特別有用。Millipore公司供有一種稱為Microcon濾筒的離心超濾裝置，可以有效地進(jìn)行核酸的脫鹽和濃縮。下述方案及加注采自Millipore公司的網(wǎng)站(WWW.millipore.com)，詳細(xì)說明可從該網(wǎng)站上查找。

(1)選擇一種型號的Microcon，其核苷酸截留值等于或小于待分離核酸的大小(見表 A8-3)。

(2)如圖A8-3所示，從提供的兩只小管中取出一只，將Microcon濾筒插入其中。

(3)濃縮時(不影響鹽的濃度)，可移取最多達(dá)500ul的樣品(DNA或RNA)加到樣品池中，按說明書推薦的時間離心，轉(zhuǎn)速不要超過表A8-3列出的離心力。

(4)若進(jìn)行鹽的交換，加適量適當(dāng)?shù)南♂屢?，使?jié)饪s樣品的體積至500ul。按說明書推薦的時間離心，轉(zhuǎn)速不要超過表A8-3列出的離心力。欲使鹽的濃度更低，必要時可重復(fù)整個步驟。見表A8-3的腳注。

重要：樣品池不要加得太滿。

(5)從小管上取下樣品池，倒置插入另一只小管中(在分析樣品之前要留存濾液)。

(6)在一只微型離心管中于500—1000g離心2min回收小管中的核酸。

(7)取下樣品池，蓋緊管蓋保藏樣品。

圖A8-3 用Microcon超離心進(jìn)行核酸溶液的濃縮及脫鹽

表A8-3 微型濃縮gSMic忱on的核苷酸截留值