|
實驗概要 Annexin V是一種檢測細(xì)胞凋亡的試劑，本實驗介紹了一個用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的方法(Annexin V 法)。 實驗原理 Annexin V是檢測細(xì)胞凋亡的靈敏指標(biāo)之一。它是一種磷脂結(jié)合蛋白，可以與早期凋亡細(xì)胞的胞膜結(jié)合，而細(xì)胞質(zhì)膜的改變是細(xì)胞發(fā)生凋亡時最早的改變之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由質(zhì)膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，因而與細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合。由于在發(fā)生凋亡時，磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的改變，因此，與DNA碎片檢測比較，使用Annexin V可以更早地檢測到凋亡細(xì)胞。因為細(xì)胞壞死時也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，所以Annexin V常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞(Annexin V /核酸染料-)與死亡細(xì)胞(Annexin V /核酸染料 )。 主要試劑 1. PBS緩沖液：含0.1%NaN3，過濾后2-8°C保存。 2. Annexin V Binding Buffer緩沖液(Cat. No. 66121E)：濃度為10×，使用時，用稀釋為1×濃度的應(yīng)用液。 3. Annexin V試劑與核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或 Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X) Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E) Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)
主要設(shè)備 1. 一次性12×75mm Falcon試管。 2. 微量加樣器和加樣頭。 3. FACS流式細(xì)胞儀：上樣檢測。 4. CELLQuest軟件：獲取和分析試驗數(shù)據(jù)。 5. Annexin V檢測對照管： Annexin V A-陰性對照 B-補償1 C-補償2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin和SAv-FITC PI和SAv-FITC PE 未染色細(xì)胞 Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色細(xì)胞 Annexin V-FITC PI
實驗步驟 1. 取Falcon試管，按標(biāo)本順序編好陰性對照管和標(biāo)本管號。 2. 使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用1× Binding Buffer緩沖液制成1×106細(xì)胞/ml的懸液。 3. Falcon試管中加入100 μl細(xì)胞懸液。 4. 按以下體積加入Annexin V與核酸染料： 管號 名稱 熒光標(biāo)記Annexin V 核酸染料 1 陰性對照 - - 2 單陽1 AV-FITC - 3 單陽2 - PI 4 樣本 AV-FITC PI 5. 輕輕混勻，室溫(20°C ~25°C)避光處放置15分鐘。 6. *使用Annexin V-Biotin試劑進行檢測時： 1×Binding Buffer緩沖液洗細(xì)胞一次，去上清。 1×Binding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細(xì)胞管中。 輕輕混勻。 加入5μl PI，室溫(20-25°C)避光處放置15分鐘。 7. 各試驗管中分別加入1×Binding Buffer緩沖液400μl。 8. 1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀測定結(jié)果。 |
|
|
